高產酒精酵母菌株及甘薯品種篩選

聶世現，王 鈺，*，黃文靜，季必霞，葉亞峰，劉小平

（1.安徽大學生命科學學院，安徽省生態工程與生物技術重點實驗室，安徽合肥230039；2.安徽省農科院作物研究所，安徽合肥230031）

高產酒精酵母菌株及甘薯品種篩選

聶世現1，王 鈺1，*，黃文靜1，季必霞1，葉亞峰1，劉小平2

（1.安徽大學生命科學學院，安徽省生態工程與生物技術重點實驗室，安徽合肥230039；2.安徽省農科院作物研究所，安徽合肥230031）

以酒曲中篩選到的酵母菌A4為出發菌株，用紫外線對其原生質體進行物理誘變，經過三級篩選得到突變高產菌株A4-20。以麥芽汁為基質發酵72h后，酒精度為4.93%，較出發菌株提高了28.7%。經過連續轉接10代，A4-20的發酵性能表現穩定。用其對6種高淀粉品種甘薯淀粉進行發酵實驗，得出3個品種的酒精產量均達14%以上，其中徐薯22酒精產量達到最高14.87%，出酒率為38.1%，經比較，徐薯22、皖薯3號和199031-1更適合應用于酒精產業。

原生質體，紫外線誘變，甘薯，酒精，發酵

石油是當今世界上主要的能源之一，其儲備有限。20世紀70年代世界范圍發生石油危機，使利用可再生的資源（如高淀粉作物）發酵生產酒精作為生物能源的研究成為人們關注的焦點。生物能源與石油相比具有可再生、污染率小、減少溫室效應等優點，能部分或全部代替汽油。目前，燃料酒精的生產占世界酒精總產量的66%，并且還有進一步增加的趨勢［1］。發酵法是酒精生產的重要方法，發酵法生產酒精的關鍵是酵母菌株，酒精酵母的優劣不僅直接影響發酵率的高低，而且會影響酒精的產量和質量。我國酒精生產行業中普遍存在亟待解決的問題是發酵強度低，生產成本高，能耗大［2］。因此，高產酒精酵母的選育是提高酒精產率，節約生產能源的關鍵。我國是世界上最大的甘薯生產國并有著豐富的甘薯種質資源，甘薯作為燃料酒精的原材料必將在我國擁有廣闊的市場前景。高淀粉型甘薯品種不一定是高產燃料乙醇型品種。本文探討了酵母菌A4原生質體紫外線誘變篩選方法，旨在篩選出發酵力強、酒精產量高的優良酵母菌株，并用此菌株對不同高淀粉品種甘薯淀粉進行發酵實驗，比較各品種間差異，找出更適合應用于酒精產業的燃料乙醇型甘薯品種，從而促進我國甘薯生產燃料酒精的推廣應用。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

酵母菌（A4） 本實驗室保藏菌種；麥芽汁 合肥市華潤雪花啤酒廠；YPD培養基 參考文獻［3］；原生質體再生培養基 在YPD固體培養基中添加KCl至0.7mol/L；TTC上、下層培養基 參考文獻［4］；預處理劑 0.1%β-巰基乙醇，其中含0.1mol/L的EDTA-2Na；KCl高滲緩沖液 在緩沖液中添加KCl至0.7mol/L；蝸牛酶液 將1.5%的蝸牛酶溶于高滲緩沖液中，微孔濾膜過濾除菌；α-淀粉酶（最適溫度50～70℃，酶活3700U/g）、糖化酶（酶活10萬U/g） 北京博奧星生物技術有限公司；高淀粉甘薯品種 徐薯18、徐薯22、青農2號、199031-1、栗子香，本實驗室種植；皖薯3號 安徽省農科院提供。

SCV系列Streamline垂直流超凈工作臺 新加坡藝思高科技有限公司；MLS-3750全自動高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司；SP-721E型可見光分光光度計 上海光譜儀器有限公司；微孔濾膜 上海生工生物工程有限公司。

表1 誘變后的再生菌經TTC篩選的結果

表2 10%酒精度下各菌株的產氣情況

1.2 實驗方法

1.2.1 出發菌株的原生質體制備［5-6］將活化好的菌種接種于盛有50mL YPD液體培養基的錐形瓶中，28℃，200r/min搖床培養10h，取5mL菌液3500r/min離心5min，用磷酸-檸檬酸緩沖液洗2次，無菌加入0.1%β-巰基乙醇，28℃靜置10min，用高滲緩沖液洗滌3次，取1mL菌液離心棄上清液，加入1.5%的蝸牛酶液，30℃水浴1.5h，2000r/min離心10min，高滲緩沖液洗滌2次后稀釋至10-4待用。

1.2.2 原生質體紫外誘變 取稀釋至10-4后的原生質體懸液5mL于無菌平皿中，置于20W紫外燈下距離30cm照射不同時間后涂布于高滲平板和普通平板，同時作對照組，于28℃避光培養72h，待長出菌落后計算其存活率［7］。

1.2.3 酵母菌的篩選 參考文獻［8］。一級篩選：TTC平板法；二級篩選：耐酒精性測定；三級篩選：麥芽汁發酵法。

1.2.4 遺傳穩定性實驗［7］鑒于誘變菌株的性狀常不穩定，連續繼代培養時可能出現退化現象。為了檢測正突變菌株遺傳性狀是否穩定，將正突變菌株傳代培養10代，測定其酒精產量。

1.2.5 甘薯淀粉提取方法 取鮮甘薯洗凈，切成小塊放于勻漿機中加水打成勻漿，用4層紗布過濾漿液并加水反復揉洗，靜置使過濾液中淀粉沉淀，取沉淀淀粉烘干待用。

1.2.6 甘薯淀粉發酵實驗 取200mL料液（甘薯淀粉∶水=1∶3）于錐形瓶中，以10～40U/g的量加入α-淀粉酶65℃水浴1h，沸水浴10min使其液化完全，以300U/g的量加入糖化酶60℃水浴1h，調pH為4.5，加入1%的酵母提取物和5%的菌種于30℃條件下發酵96h，每24h測其失重量，發酵結束后檢測發酵液各指標，本實驗重復3次。

1.2.7 發酵液的檢測方法 酒精濃度測定：蒸餾法［9］；還原糖、總糖測定：DNS法［10］；CO2失重的測定：直接稱重法；原料出酒率計算：原料出酒率（%）=酒精產量（95%）/原料耗用量×100%。

2 結果與討論

2.1 酵母菌的篩選

2.1.1 一級篩選 原生質體懸液經紫外燈（20W）不同時間（7個梯度）照射誘變處理后，涂布于再生培養基培養。將誘變后的再生菌落用TTC平板法進行一級篩選。產酒精能力強的酵母菌落呈深紅色，次之為粉紅色、微紅色或不顯色［11］。以出發菌株為對照，顯色后顏色比出發菌株深者為正突變，結果（見表1）可看出，經30s和40s照射處理的效果較好，共得到32株酵母菌，隨機編號為A4-1～A4-32，轉斜面保存作為二級篩選的出發菌株。

2.1.2 二級篩選 在酒精發酵時，產物酒精的濃度過高會對酵母造成一定的毒害作用，抑制酵母的生長及發酵活性。所以，酵母的發酵能力在很大程度上取決于它們自身酒精耐受力的大小。本實驗通過杜氏管發酵，測定酵母菌在外加10%酒精的發酵液中的產氣速度和產氣量。若無氣泡產生表示無發酵現象，說明菌株不耐10%的酒精；若有氣泡產生表示有發酵現象，氣泡產生的早晚、產氣速度和產氣量多少反映菌株耐酒精的程度。對不同酵母菌株的酒精耐性進行比較，結果見表2。

由表2可看出，A4-5、A4-8、A4-9、A4-10、A4-18、A4-19、A4-20、A4-23、A4-24和A4-25，產氣時間較早，速度較快，產氣量較多，將其選出作為三級篩選的出發菌株。

表3 突變菌株麥芽汁培養基發酵結果

表4 不同品種甘薯淀粉發酵結果

2.1.3 三級篩選 將二級篩選出的10株突變菌株活化后接種于麥芽汁發酵培養基中，在30℃進行發酵實驗（重復3次），發酵終止時測酒精產量和發酵液的殘糖量，結果見表3。

由表3可看出，A4-9、A4-18、A4-19、A4-20、A4-24突變菌株酒精產量明顯增加，A4-20尤為明顯，酒精產量達到4.93%，殘糖量較低，CO2失重量最大。CO2釋放量與產酒精率有很大關系，總失重值愈大，產酒精量愈多［12］。表 3中 A4-10，A4-23和A4-25突變株酒精產量沒有增加，甚至降低。這可能是不同酵母菌株的生長代謝過程有差異，對可發酵性糖的利用方式有區別，這3株菌可能更多的是利用發酵性糖進行細胞的生長繁殖，從而減少發酵性糖轉化為酒精的量。另外，這3株酵母菌發酵糖產酒精的穩定性較差。

2.1.4 遺傳穩定性實驗 將A4-20連續傳代10次，測定其發酵酒精產率，并與初代進行比較。經測定，初代酒精度為4.9%，第10代酒精度為4.8%。結果表明，A4-20的發酵性能無明顯變化，表現穩定，酒精產率穩定在4.9%左右。

2.2 燃料乙醇型甘薯品種篩選

為了測定A4-20在高淀粉品種甘薯發酵中的酒精產量，將A4-20接種于發酵液中，其發酵結果見表4。

由表4可知，徐薯22、皖薯3號、199031-1酒精產量均達14%以上，其中徐薯22酒精產量達到最高14.87%，出酒率為38.1%。SPSS17.0單因素方差分析結果顯示，6個甘薯品種酒精度差異顯著（P＜0.05），進一步Duncan檢驗結果表明，徐薯22酒精度與其它品種相比差異顯著（P＜0.05）。但徐薯22和皖薯3號殘還原糖和殘總糖相對較高，說明A4-20對其可發酵性糖利用不徹底。淀粉率是評價淀粉型甘薯的重要指標，淀粉率越高甘薯中淀粉含量越高，高淀粉品種甘薯在酒精產業中更具有市場前景。由表4可知，皖薯 3號淀粉率最高達 24.35%，而199031-1只有19.48%。雖然徐薯18和栗子香淀粉率達到24.17%和23.91%，但是其酒精產量僅達13.8%和13.6%，與其它品種相比產量相對較低。盡管栗子香酒精產量和出酒率在6個品種中最低，但是其殘還原糖和殘總糖量最低，由此可知A4-20對栗子香的可發酵性糖利用最徹底。青農2號在6個供試品種中各方面指標均處于中等水平。SPSS17.0軟件Pearson相關性分析可知發酵酒精度和淀粉率無顯著相關性（r=-0.621，P=0.189）。

3 結論

本實驗對酵母菌A4原生質體進行了紫外線誘變并通過三級篩選得到發酵性能穩定的突變菌株A4-20，發酵麥芽汁72h，酒精產率4.93%，比出發菌株的酒精產率提高了28.7%。用其對6種高淀粉品種甘薯淀粉進行發酵實驗，得出3個品種酒精產量均達14%以上，其中徐薯22酒精產量最高，綜合比較酒精產量和淀粉率兩個指標，在6個燃料乙醇型高淀粉品種甘薯中徐薯22、皖薯3號和199031-1更適合應用于酒精產業。但是本實驗也存在一定不足，如A4-20對徐薯22和皖薯3號的可發酵性糖利用不徹底造成了原料的浪費。為進一步提高酒精產量和原料利用率，我們將進一步改進發酵條件。

［1］黃宇彤，杜連祥.玉米原料酒精高濃度發酵中間實驗的研究［J］.天津輕工業學院學報，2002（1）：6-8.

［2］李艾，郝玉翠，郝斌.耐高溫高產酒精酵母的篩選及生理特性的初步研究［J］.唐山學院學報，2009，22（3）：74-76.

［3］趙悅茗，杜躍超，羅晨.安琪超級釀酒酵母原生質體制備與再生條件研究［J］.釀酒科技，2008（1）：17-20.

［4］張曉霞，王瑩，劉長江.甜高粱莖稈汁液酒精發酵高產菌株的選育［J］.研究與實驗，2006（2）：32-37.

［5］孫金旭.乳酒酵母紫外誘變原生質體制備研究［J］.釀酒科技，2008（6）：65-71.

［6］俞志敏，欒靜，徐鵬，等.耐高糖釀酒酵母原生質體制備與再生過程研究［J］.釀酒科技，2008（4）：45-48.

［7］張春紅，賈茹珍.甜高粱稈汁高產酒精酵母原生質體的誘變選育［J］.中國釀造，2007（12）：25-28.

［8］張偉，朱會霞，李英軍，等.Co60誘變原生質體選育高產酒精酵母［J］.釀酒科技，2006（1）：23-26.

［9］吳帥，肖冬光，原通磊，等.高耐性釀酒酵母菌種的篩選［J］.釀酒科技，2006（9）：37-40.

［10］李進華，周忠澤.基礎生物學實驗［M］.合肥：安徽大學出版社，2005：256-268.

［11］王梅，張澎湃，帥桂蘭.TTC在黃酒酵母選育中的應用［J］.釀酒，2001，28（5）：62-64.

［12］劉小平，胡建勛，王鈺，等.甘薯品種內涵品質與發酵酒精產量關系的初步研究［J］.安徽農業科學，1997，25（3）：203-204.

Screening of high yield alcohol yeast and sweet potato varieties

NIE Shi-xian1，WANG Yu1，*，HUANG Wen-jing1，JI Bi-xia1，YE Ya-feng1，LIU Xiao-ping2
（1.Provincial Key Laboratory of Eco-engineering and Bio-technique，College of Life Science，Anhui University，Hefei 230039，China；2.Crop Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei 230031，China）

The current study was to select A4 from distillers yeast as original strain.Strain A4-20 was screened as a high-alcohol-yield strain by UV-mutation of protoplast and three steps screening method.Through wort fermentation for 72h，the alcohol content reached 4.93%，which was 28.7%higher than the original stain.After switched over 10 generations，and the fermentation by A4-20 was not significant difference.Using A4-20 fermented the starch of 6 high starch varieties of sweet potato，the results showed that the alcohol concentration of three varieties reached more than 14%.The highest alcohol concentration and yield of liquor in Xushu 22 was 14.87%and 38.1%，respectively.Xushu 22，Wanshu 3 and 199031-1 were comparatively suitable for alcohol industry.

protoplast；UV-mutation；sweet potato；alcohol；fermentation

TS262.2

A

1002-0306（2011）02-0159-04

2010-02-04 *通訊聯系人

聶世現（1984-），男，碩士研究生，研究方向：細胞工程。

安徽省教育廳重點項目（KJ2008A077）。