樹脂固定化α-乙酰乳酸脫羧酶的初步研究

陳 卿，蔡國林，陸 健，*

（1.江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

樹脂固定化α-乙酰乳酸脫羧酶的初步研究

陳 卿1，2，蔡國林2，陸 健1，2，*

（1.江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

采用7種樹脂對α-乙酰乳酸脫羧酶進(jìn)行固定化，并將固定化酶應(yīng)用于啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，從中篩選出降低發(fā)酵液中雙乙酰能力較強(qiáng)的大孔弱堿性丙烯酸系陰離子交換樹脂D314FD作為固定化的載體。通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定固定化ALDC的最優(yōu)條件為：每克樹脂加入1.25mL原酶液，吸附時(shí)間10h，吸附pH7.5，吸附溫度15℃，在此條件下固定化效率可達(dá)44%。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)亦表明，固定化ALDC可以顯著降低發(fā)酵液中雙乙酰的含量，降低率達(dá)40%以上。

樹脂，α-乙酰乳酸脫羧酶，固定化

在啤酒發(fā)酵過程中，雙乙酰是影響啤酒風(fēng)味成熟、熟化期長短的主要因素。當(dāng)雙乙酰含量超過閾值（0.15mg/L）時(shí)，會(huì)產(chǎn)生令人不愉快的餿酸味，嚴(yán)重影響啤酒的口味［1］。啤酒中雙乙酰的來源復(fù)雜，主要是由滲漏到酵母細(xì)胞外的代謝產(chǎn)物α-乙酰乳酸，經(jīng)非酶氧化脫羧作用產(chǎn)生。α-乙酰乳酸的非酶氧化脫羧反應(yīng)是緩慢進(jìn)行的，其速度比雙乙酰還原速度約慢10倍，是雙乙酰還原的限時(shí)步驟［2］。傳統(tǒng)除雙乙酰的方法是低溫儲存啤酒，依靠酵母雙乙酰還原酶將其還原成乙偶姻，再由乙偶姻還原酶最終還原為2，3-丁二醇。乙偶姻和2，3-丁二醇的味閾值較高，對啤酒的風(fēng)味幾乎沒有影響。而這一熟化過程通常需要3～6周時(shí)間［3］。α-乙酰乳酸脫羧酶（α-acetolactate decarboxylase，簡稱ALDC，EC 4.1.1.5）可以使啤酒發(fā)酵液中的α-乙酰乳酸不經(jīng)雙乙酰途徑，快速直接脫羧為乙偶姻。因而能縮短雙乙酰的還原時(shí)間，加速啤酒的成熟，并可有效控制啤酒在儲藏過程中雙乙酰的反彈［4-6］。將ALDC應(yīng)用于啤酒發(fā)酵，雖可縮短生產(chǎn)周期，但ALDC卻不能反復(fù)使用，增加生產(chǎn)成本。而酶的固定化技術(shù)可以克服游離ALDC的上述缺點(diǎn)［7］。目前固定化技術(shù)基本上都停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，這主要是因?yàn)楣潭ɑ玫妮d體材料幾乎都集中在海藻酸鹽、殼聚糖等有機(jī)材料上，雖然固定化效果較好，但由于載體材料耐腐蝕性差、不抗壓、易變形，且無法再生，因而限制了此技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用。樹脂是工業(yè)上使用最廣泛的材料之一，其價(jià)格低廉、機(jī)械強(qiáng)度好、容易再生，作為固定化載體有著廣闊的應(yīng)用前景［8］。本文從7種樹脂中篩選出固定化ALDC效果良好的載體D314FD，對ALDC的固定化條件和固定化酶的應(yīng)用進(jìn)行相關(guān)研究，期望能夠?yàn)楣I(yè)化經(jīng)濟(jì)、高效應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

ALDC 購自寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；樹脂分別購自浙江爭光樹脂實(shí)業(yè)公司與上海摩速科學(xué)器材有限公司；乙偶姻、2-乙酰-2-甲基乙酰乙酸乙酯（底物） 購自Sigma公司；MES［2-（N-嗎啉代）乙基磺酸］、氯化鈉、Brij35（布里吉）、氫氧化鈉、α-萘酚、肌酸等 均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固定化載體的預(yù)處理 離子交換樹脂先用蒸餾水浸泡脹潤、去雜，然后用HCl、NaOH交替處理，最后用蒸餾水沖洗至中性；吸附樹脂采用乙醇、蒸餾水交替處理，最后用蒸餾水沖洗至中性，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 載體的選擇 取處理后樹脂約1.00g，分別加入5mL含一定量原酶液的磷酸緩沖液（pH6.0、0.2mol/L）中，搖勻，在搖床上15℃，120r/min振搖12h后抽濾，用去離子水洗滌數(shù)次，至洗滌液中無蛋白檢出。將所得固定化ALDC應(yīng)用于啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，根據(jù)固定化酶對發(fā)酵液中雙乙酰的降低率進(jìn)行固定化載體的選擇。

1.2.3 ALDC固定化條件的優(yōu)化 取適量預(yù)處理樹脂，用濾紙吸干表面的水分，稱取0.20g，加入不同體積的原酶液，并用0.2mol/L，pH5.0～8.5的磷酸緩沖液補(bǔ)充至5mL，在5～25℃，120r/min下吸附固定1～12h。抽濾，并用去離子水反復(fù)洗滌樹脂，抽濾得到固定化酶，置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 游離酶活力測定 將樣品酶液進(jìn)行稀釋，取20μL稀釋酶液于試管中，加 MES緩沖液300μL，30℃水浴預(yù)熱10min，將底物混合液同時(shí)放入30℃水浴預(yù)熱10min；在反應(yīng)管中加入80μL底物混合液，迅速混勻后立即置于30℃恒溫水浴中，精確反應(yīng)20min后，迅速加入4.6mL顯色劑（0.1%肌酸，1% α-萘酚的1mol/L NaOH溶液），混勻，置30℃顯色40min后于522nm處讀取吸光值。用MES緩沖液代替樣品酶液的反應(yīng)管作為空白對照。

酶活力定義：在pH6.0，30℃條件下，每分鐘水解出1μmol乙偶姻的量定義為一個(gè)酶活單位（U）。

1.2.5 固定化酶活力測定 取適量固定化酶代替20μL稀釋酶液于試管中，之后步驟同1.2.4。

1.2.6 雙乙酰、酒精度、外觀濃度、真正濃度、α-FAN的測定 參考文獻(xiàn)［9］。

1.2.7 計(jì)算方法［10］相對酶活力：以同組樣品中酶活力的最大值作為100%，其它值與最大值的百分比即為相對活力；固定化效率（%）=（加入酶總活力-上清液酶總活力）/加入酶總活力×100%；雙乙酰降低率（%）=（加酶前雙乙酰含量-加酶后雙乙酰含量）/加酶前雙乙酰含量×100%

1.2.8 正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法 本實(shí)驗(yàn)需要考察兩個(gè)指標(biāo)，一個(gè)是固定化酶活力（x），另一個(gè)是固定化效率（y）。這兩個(gè)指標(biāo)的重要性有所不同，固定化酶活力的重要性比固定化效率的重要性大，因而確定二者的權(quán)重系數(shù)分別為2/3和1/3，按照加權(quán)平均法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過公式z=（2/3）x+（1/3）y，得到綜合評分z。

1.2.9 常規(guī)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)方法 主酵使用下面酵母，11℃將酵母接入11°P左右的麥汁中，按照圖1的發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵。

圖1 發(fā)酵工藝曲線

1.2.10 固定化ALDC啤酒連續(xù)發(fā)酵方法 按照圖1所示的方法，待發(fā)酵至后酵2.5d時(shí)，將發(fā)酵液存于緩沖罐1中，通過恒流泵2將其以一定的流速泵入固定化ALDC酶反應(yīng)柱3中，進(jìn)行啤酒連續(xù)發(fā)酵，還原其中的雙乙酰，最終所得啤酒存于貯罐4中。將該系統(tǒng)放于生化培養(yǎng)箱中，控制系統(tǒng)的反應(yīng)溫度，并在酶反應(yīng)柱進(jìn)、出口處分別設(shè)有取樣口。

圖2 固定化α-乙酰乳酸脫羧酶啤酒連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂載體的選擇

本實(shí)驗(yàn)中采用物理結(jié)合法對ALDC進(jìn)行固定化，其是依靠離子鍵、氫鍵、范德華力等結(jié)合的一種固定化方法，該方法載體價(jià)廉易得，安全無毒，操作條件溫和簡單，易于工業(yè)化放大生產(chǎn)應(yīng)用。所選用載體的物理化學(xué)性質(zhì)對酶的固定化效果有重大影響，不同樹脂對ALDC固定化效果的影響如表1所示。從表1中可以看出，不同載體對ALDC的固定化效果差別顯著，其中丙烯酸系大孔弱堿性陰離子交換樹脂D314FD固定ALDC，可以有效地降低發(fā)酵液中的雙乙酰的含量，雙乙酰降低率達(dá)50%以上，降低效果顯著。通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終確定選擇D314FD作為ALDC的固定化載體，并對其最適固定化條件做了進(jìn)一步的研究。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)研究反應(yīng)條件對ALDC固定化的影響

2.2.1 加酶量對固定化效果的影響 按照1.2.3方法，恒定其他條件（pH6.0，溫度15℃，吸附時(shí)間8h），選擇不同的原酶液添加量（0.25、0.50、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50mL）分別制備固定化ALDC，測定固定化酶活力。研究不同加酶量對固定化效果的影響，結(jié)果如圖3所示。從圖3可知，隨著加酶量的增加，固定化酶的相對酶活力和固定化效率均有所增加，當(dāng)5mL酶液中原酶液的添加量為1.25mL時(shí)，相對酶活力增幅緩慢；在此添加量之后，隨著加酶量的增加，載體上酶分子密度增大，位阻效應(yīng)加劇，底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散受到某種程度的限制，導(dǎo)致固定化效率開始呈降低趨勢［11］，兼顧固定化酶相對活力和固定化效率這兩者，選擇5mL酶液中原酶液的添加量為1.25mL，此時(shí)ALDC的固定化效率可達(dá)43%。

表1 不同樹脂對α-乙酰乳酸脫羧酶固定化效果的影響

圖3 加酶量對固定化效果的影響

2.2.2 吸附時(shí)間對固定化效果的影響 在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，研究不同吸附時(shí)間（1、2、4、6、8、10、12h）對固定化酶活力和固定化效率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 吸附時(shí)間對固定化效果的影響

從圖4可以看出，10h為最佳吸附時(shí)間。10h之前，隨著吸附時(shí)間的延長，酶的相對活力和固定化效率呈上升趨勢；當(dāng)吸附時(shí)間高于10h時(shí)，隨著時(shí)間的延長，固定化效率呈下降趨勢。一方面是因?yàn)?0h時(shí)，固定化酶的相對活力不再增加，樹脂吸附ALDC達(dá)到飽和；另一方面，隨著吸附時(shí)間的延長，游離酶活力下降。因此選擇 10h作為 D314FD固定化ALDC的吸附時(shí)間。

2.2.3 吸附溫度對固定化效果的影響 在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，研究不同吸附溫度（5、10、15、20、25℃）對固定化酶活力和固定化效率的影響，結(jié)果如圖5所示。從圖5可知，當(dāng)吸附溫度在10～15℃時(shí)，吸附溫度的微小變化不會(huì)引起固定化酶相對活力和固定化效率的急劇變化；當(dāng)溫度大于15℃時(shí)，固定化酶相對活力和固定化效率降低速度加快。其原因可能是，長時(shí)間的振蕩，使得部分ALDC活力有所下降［12］。鑒于蛋白質(zhì)的吸附是一個(gè)吸熱過程，因此選擇15℃作為ALDC的固定化溫度。

圖5 吸附溫度對固定化效果的影響

2.2.4 吸附pH對固定化效果的影響 在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，即每克樹脂加1.25mL原酶液，15℃，吸附10h條件下，改變吸附pH，研究不同pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）對固定化效果的影響，結(jié)果如圖6所示。從圖6可知，pH在7.0～7.5時(shí)，固定化效果最好。低于或高于此pH，固定化效率都有所降低。這主要是因?yàn)榫彌_液pH的改變，會(huì)造成載體表面、酶分子表面的電荷分布以及載體與酶分子之間作用力的改變。已知所使用ALDC的等電點(diǎn)為4.5，所以一定要保證吸附pH大于4.5，使酶蛋白帶負(fù)電荷，與陰離子交換樹脂進(jìn)行離子交換將其吸附到載體上；但若pH過高，也會(huì)影響ALDC的活性中心進(jìn)而使固定化酶活力降低。

圖6 吸附pH對固定化效果的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)確定ALDC固定化最優(yōu)條件

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以加酶量、吸附時(shí)間、溫度、pH四個(gè)因素的不同水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，考察不同因素之間對固定化效果影響的綜合效應(yīng)，確定ALDC固定化的最優(yōu)條件，結(jié)果見表2和表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

從表3數(shù)據(jù)可以看出，不同的固定化條件，所制得的固定化ALDC的酶活力和固定化效率有一定的差別。其中第4組實(shí)驗(yàn)的綜合得分最高，固定化酶的活力最高，固定化效率為42.72%，實(shí)驗(yàn)條件為A2B1C2D3。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)的極差分析可知：C因素（吸附溫度）的極差值6.776最大，故其對ALDC固定化效果的影響也最大；D因素（吸附pH）的極差值2.800最小，對固定化效果的影響也較小。四個(gè)因素對ALDC固定化效果影響的主次順序?yàn)椋何綔囟龋炯用噶浚疚綍r(shí)間＞吸附pH。通過K值確定最優(yōu)水平組合為：A2B2C2D3，即加酶量1.25mL，吸附時(shí)間10h，吸附溫度15℃，pH7.5。而該條件在表3所列的實(shí)驗(yàn)中并沒有出現(xiàn)，因此需要對此條件進(jìn)行驗(yàn)證。以最優(yōu)組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定固定化酶活力和計(jì)算固定化效率，結(jié)果表明：固定化酶的相對活力為105%，固定化效率為44%，其綜合評分（z）為84.67，最高。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，說明正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)論是正確的。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 固定化ALDC在釀造啤酒上的應(yīng)用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證ALDC的固定化效果，并初步探索固定化ALDC在啤酒釀造中的應(yīng)用模式及其工藝，本文設(shè)計(jì)了重復(fù)分批酶解實(shí)驗(yàn)和連續(xù)酶解實(shí)驗(yàn)。2.4.1 重復(fù)分批酶解實(shí)驗(yàn) 在250mL三角瓶中加入200mL發(fā)酵一定時(shí)間的嫩啤酒發(fā)酵液和10g（以濕重計(jì)）固定化ALDC，在6℃，80r/min條件下反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，取樣測定雙乙酰的含量，計(jì)算雙乙酰降低率。同時(shí)將分離出來的固定化ALDC，用無菌水反復(fù)洗滌數(shù)次后，添加到新的發(fā)酵液中進(jìn)行下一批次的酶解反應(yīng)。如此重復(fù)進(jìn)行8次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示。

圖7 固定化α-乙酰乳酸脫羧酶重復(fù)分批酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從圖7中可知，隨著固定化ALDC使用次數(shù)的增加，其雙乙酰降低率由43%降至35%，降幅較小。所以，通過固定化條件的優(yōu)化，所制備的固定化ALDC的催化性能相當(dāng)穩(wěn)定，且催化活力較高。這一結(jié)果對于提高酶的重復(fù)利用率，降低生產(chǎn)成本具有重大意義。

2.4.2 連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 在120mL自制玻璃柱中裝填濕重35g固定化ALDC，將發(fā)酵至后酵2.5d的嫩啤酒發(fā)酵液通過恒流泵以0.165mL/min的流速由底部進(jìn)料，頂部出料，此時(shí)反應(yīng)體系的保留時(shí)間約為12h，待系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，對流出樣進(jìn)行常規(guī)理化指標(biāo)的測定（多次測定，取平均值），與實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)后酵發(fā)酵液相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行比較。并通過t檢驗(yàn)，比較了柱前、柱后發(fā)酵液常規(guī)理化指標(biāo)間的差異性，結(jié)果如表4和表5所示。

表4 啤酒主要理化指標(biāo)的比較

表5 反應(yīng)柱前與柱后發(fā)酵液常規(guī)理化指標(biāo)間t檢驗(yàn)結(jié)果

從表4可知，固定化ALDC反應(yīng)柱前和柱后發(fā)酵液中雙乙酰含量差別顯著，在保留時(shí)間為12h后，固定化柱流出液中的雙乙酰含量為0.090mg/L，雙乙酰降低率達(dá)44%。通過對反應(yīng)柱前與柱后發(fā)酵液其他常規(guī)理化指標(biāo)進(jìn)行t檢驗(yàn)（表5），結(jié)果表明：在外觀濃度和真正濃度這兩項(xiàng)指標(biāo)上柱前與柱后發(fā)酵液間存在差異，從表4亦可知，固定化柱后比柱前發(fā)酵液的外觀濃度和真正濃度平均低約0.2°P；而外觀發(fā)酵度和實(shí)際發(fā)酵度是通過外觀濃度和真正濃度計(jì)算得出，故而也存在一定的差異。這主要是因?yàn)闃渲糠治桨l(fā)酵液中蛋白質(zhì)的緣故所致。實(shí)驗(yàn)室常規(guī)后酵工藝至少需要7d才可以將雙乙酰含量降至0.100mg/L，而采用固定化ALDC新工藝釀造啤酒達(dá)到相同的雙乙酰含量水平時(shí)只需要3d左右即可，故而采用新工藝可以明顯縮短發(fā)酵時(shí)間。從表4可知，使用固定化酶連續(xù)工藝生產(chǎn)的啤酒，其主要理化指標(biāo)（除雙乙酰）與常規(guī)工藝生產(chǎn)的啤酒比較接近。

3 結(jié)論

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，已經(jīng)研究了殼聚糖、聚乙烯醇、磁性淀粉和IMMOPORE（一種多孔玻璃）等材料作為固定化 ALDC的載體［3，13-15］，而用樹脂進(jìn)行ALDC固定化的報(bào)道甚少。由于ALDC主要應(yīng)用于釀酒行業(yè)，本文所選用的ALDC固定化載體D314FD樹脂，屬于食品級樹脂，因而使得固定化ALDC在使用上具有安全性。

本文應(yīng)用吸附法固定化ALDC，方法簡單，操作容易。通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)得出固定化ALDC的最優(yōu)條件為：在pH7.5磷酸緩沖液下，每克樹脂加入1.25mL原酶液，15℃吸附10h。在此條件下固定化ALDC的固定化效率可達(dá)44%。

將采用優(yōu)化條件制得的固定化ALDC初步應(yīng)用于啤酒釀造實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)固定化ALDC的催化效率較高，性能穩(wěn)定，重復(fù)使用8次后雙乙酰降低率降幅較小。采用固定化ALDC反應(yīng)柱系統(tǒng)進(jìn)行啤酒連續(xù)發(fā)酵，在保留時(shí)間為12h時(shí)，該工藝所得的發(fā)酵液與常規(guī)工藝的發(fā)酵液，在常規(guī)理化指標(biāo)上比較接近，并沒有顯著差異。ALDC固定化的成功為其在工業(yè)上的應(yīng)用提供了參考。

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Preliminary study on immobilization of α-acetolactate decarboxylase by resin

CHEN Qing1，2，CAI Guo-lin2，LU Jian1，2，*
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Alpha-acetolactate decarboxylase was immobilized on 7 kinds of resins through adsorption，and then they were used in beer maturation.Among them，weak macroporous ion-exchange resin D314FD was selected as immobilized carrier for its good ability on reducing the content of diacetyl.The results showed that the optimum conditions for α-acetolactate decarboxylase immobilized as follows：1.25mL liquid α-acetolactate decarboxylase was added into one gram of pretreated resin，stirred for 10h at 15℃ in buffer of pH7.5.Under the optimal conditions，the immobilization efficiency could reach 44%.Fermentation trial also showed that immobilized ALDC could significantly reduce the content of diacetyl，and the rate of reducing was up to 40%.

resin；α-acetolactate decarboxylase；immobilization

TS201.2+5

A

1002-0306（2011）02-0154-05

2010-03-04 *通訊聯(lián)系人

陳卿（1985-），女，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程。

國家“十一五”支撐重點(diǎn)項(xiàng)目資助（2008BAI63B06）；國家“十一五”支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2007BAK36B01）；江蘇省“青藍(lán)工程”資助項(xiàng)目。