楊梅渣黃酮類化合物提取及其抗氧化活性研究

陳學麗，葉立斌，勵建榮，*，孫金才，陳 衛，許慶炎，Zhou K.

（1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州310035；2.浙江海通食品集團，浙江慈溪315300；3.Department of Food Scienceamp;Technology，Virginia Polytechnic Institute and State University，Blacksburg Virginia 24061）

楊梅渣黃酮類化合物提取及其抗氧化活性研究

陳學麗1，葉立斌1，勵建榮1，*，孫金才2，陳 衛1，許慶炎2，Zhou K.3

（1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州310035；2.浙江海通食品集團，浙江慈溪315300；3.Department of Food Scienceamp;Technology，Virginia Polytechnic Institute and State University，Blacksburg Virginia 24061）

楊梅是我國的特產水果，年產量約為100萬t，其中楊梅渣約占果實總重的10%。目前以楊梅為資源的食品工業已初具規模，然而在楊梅深加工過程中，楊梅渣都作為廢物進行處理，對其開發利用仍然一片空白。基于此，以楊梅渣為研究對象，對楊梅渣中黃酮類化合物進行提取、濃縮、萃取，分成四個級分（石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相）；用DPPH法、Fenton反應法和還原能力評價了四個不同級分的楊梅渣提取物的體外抗氧化能力。結果表明，楊梅渣粗提物正丁醇相和乙酸乙酯相具有較強的清除DPPH自由基能力，其半抑制濃度（IC50）分別為30、40μg/mL，分別是維生素C（IC50=110μg/mL）的3.67、2.75倍。

楊梅渣，總黃酮，提取，抗氧化

楊梅中含豐富的蛋白質、維生素、檸檬酸、多糖和多酚類等多種營養和功效成分［1］，具有消食、御寒、消暑、止瀉、治療痢疾以及生津止咳、清腸胃等多種藥用價值，是水果中的醫藥珍品。現代研究表明，其中所含的黃酮類化合物［2-3］，如楊梅素、二氫楊梅素、槲皮素等具有明顯的抗潰瘍、抗炎、抗菌、抗氧化、增強機體免疫力、軟化血管、降血糖、降血脂等生理活性作用［4］。楊梅渣是楊梅榨汁或釀酒后的副產物，占楊梅總重的10%，年產量約為10萬t，且呈逐年上升趨勢，但均作為廢物處理，污染環境。開發利用楊梅渣資源，不但解決了廢渣處理所帶來的環境污染問題，而且延長了楊梅產業鏈。因此，以楊梅渣為研究對象，提取其中的黃酮類化合物，開發其藥用價值功能，對進一步利用楊梅資源具有重要的現實意義。鑒于此，本文對楊梅渣的黃酮類物質進行了提取并對其抗氧化活性進行了初步研究，為楊梅渣的進一步開發提供一定的科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

楊梅渣 浙江海通食品集團股份有限公司提供；DPPH（2，2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl） Sigma公司（Germany）。

MODULYOD-230型真空冷凍干燥機 Thermo Co.，Ltd.；UV-2550紫外可見光分光光度計SHIMADZU Co.，Ltd.；RE-52A旋轉蒸發器、循環水式多用真空泵 SHB-ⅢA 上海亞榮生化儀器廠；KQ-100型超聲波 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 楊梅渣黃酮類化合物的提取 稱取一定量的楊梅渣粉末，與70%的乙醇按料液比1∶30混勻，60℃超聲提取30min，提取兩次，真空抽濾，除去濾渣，合并濾液。濾液再經過旋轉蒸發儀（45℃）濃縮至浸膏狀。

1.2.2 楊梅渣黃酮類化合物的萃取 用三倍的去離子水溶解浸膏，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取兩次，經旋轉蒸發儀（45～55℃）濃縮至呈浸膏狀，冷凍干燥，即得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相，于超低溫冰箱保存，待用。

1.2.3 粗提物中總黃酮含量的測定

1.2.3.1 標準曲線的繪制 精密稱取 10mg蘆丁（120℃干燥至恒重），用30%的乙醇溶液溶解，置于100mL容量瓶中，加30%的乙醇溶液定容，得100μg/mL蘆丁標準溶液，備用。

準確吸取蘆丁標準溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別置于10mL刻度試管中，各加30%的乙醇至5.0mL，加5%的亞硝酸鈉0.4mL，搖勻，放置5min，再加10%的硝酸鋁溶液0.4mL，搖勻，放置5min，加4%的氫氧化鈉溶液4.0mL，搖勻，最后加30%的乙醇定容至刻度，搖勻，放置10min。在波長510nm處測定其吸光度。以濃度C（μg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.3.2 粗提物中總黃酮含量的測定［5-6］稱取0.1g粗提物，用30%的乙醇溶液溶解，置于100mL的容量瓶中，加30%的乙醇溶液定容得1mg/mL的樣品溶液，備用。每次準確量取2.0mL置于10mL刻度試管中，按照上述方法測定510nm處的吸光度，根據標準曲線求出濃度，計算總黃酮含量。

1.2.4 抗氧化作用

1.2.4.1 清除DPPH自由基的能力測定［7-10］將楊梅渣黃酮粗提物稀釋成不同濃度梯度：50、100、200、400、600μg/mL，各取2mL上述濃度的粗提液于比色管中，再加入2mL 0.1mmol/L的DPPH甲醇溶液，混合均勻，30℃避光靜置30min后測定517nm處的光吸收值。同時以相同濃度梯度的VC作為對照，重復上述操作。

DPPH自由基清除能力的計算公式為：

式中，Ab為2mL乙醇或水+2mL DPPH溶液的吸光值，Ac為2mL樣品溶液+2mL甲醇的吸光值，As為2mL樣品+2mL DPPH溶液的吸光值。

1.2.4.2 清除羥基自由基的能力測定［11］參照Fenton反應的方法建立反應體系模型，利用H2O2與二價鐵離子混合后產生·OH。Fenton反應為：H2O2+Fe2+=OH-+·OH+Fe3+，但·OH具有很強的反應活性，存活時間短，若在反應體系中加入水楊酸，能有效地捕捉·OH并產生有色產物。該產物在510nm處有較強吸收，若加入具有清除·OH功能的被測物便會與水楊酸競爭·OH，從而使有色產物的生成量減少，采用固定反應時間法，在510nm處測定吸光度，并做空白對照，便能測定被測物對·OH的清除作用。

式中：A損傷為反應體系原來的吸光度，A未損傷為加入提取液但不加入H2O2的吸光度，A加樣為反應體系加入提取液后的吸光度。

將楊梅渣黃酮粗提物稀釋成不同濃度梯度：50、100、200、400、600μg/mL。取6mmol/L水楊酸1mL于10mL試管中，加入2mmol/L的FeSO41mL，搖勻，再加入6mmol/L H2O21mL，搖勻，于37℃水浴中恒溫15min后，測定其吸光度A損傷（用水作為參比）。測定后，各加入上述濃度的粗提液 1mL，搖勻，放置10min，再測定其吸光度 A加樣，并用水代替 H2O2的A未損傷做參照，使用公式進行計算即可得清除率。同時以相同濃度的BHT和VC作為對照，重復上述操作。

1.2.4.3 還原能力的測定［12-16］將楊梅渣黃酮粗提物配成400μg/mL，取2.5mL樣品于試管中，依次加入2.5mL 0.2mol/L PBS和2.5mL 1%六氰合鐵酸鉀溶液，于50℃水浴保溫20min后快速冷卻，再加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液。然后取2.5mL于10mL比色管中，依次加入2.5mL蒸餾水，0.5mL 0.1%三氯化鐵，充分混合后，靜置10min，在700nm處［17］測定其吸光值A（以蒸餾水作參比）。吸光度值越大，表示還原力越強（以BHT和VC作對照，重復上述實驗）。

2 結果與分析

2.1 總黃酮的測定

2.1.1 標準曲線的繪制 從圖1可以看出，蘆丁濃度在0～50μg/mL范圍內，與吸光度呈現良好的線性關系，相關性達到0.9996，線性回歸方程為：y=0.0133x +0.0023，式中：y表示波長在510nm處的吸光度，x表示蘆丁的濃度。

2.1.2 粗提物中總黃酮含量的測定 根據測定結果得出各樣品中總黃酮含量，結果見表1。

表1 樣品總黃酮含量

2.2 抗氧化能力的測定

2.2.1 清除DPPH自由基的能力 DPPH自由基是一種很穩定的以氮為中心的自由基，對其清除的效果表明，樣品能有效降低羥自由基、烷自由基或過氧自由基和打斷脂質過氧化鏈反應。楊梅渣黃酮類化合物的粗提物對DPPH自由基的清除效果見圖2。

圖1 蘆丁標準曲線

圖2 粗提物對DPPH自由基的清除作用

實驗結果表明，隨著粗提物濃度的增加，清除DPPH自由基的效果越好。乙酸乙酯相和正丁醇相對DPPH自由基的清除能力大于VC，而水相和石油醚相的清除能力相對較弱。根據線性回歸方程，可以求出正丁醇相和乙酸乙酯相的IC50（即清除率達到50%時所需藥物的濃度）分別為30、40μg/mL，清除能力分別是VC的3.67倍和2.75倍（VC的 IC50為110μg/ mL），表明楊梅粗提物的乙酸乙酯相和正丁醇相表現出很強的清除DPPH自由基的能力。

2.2.2 清除羥基自由基的能力 由圖3可知，楊梅渣粗提物對·OH有著一定的清除作用，且隨著提取液濃度的增加，清除效果越好。實驗結果表明，石油醚相在清除·OH方面表現出比另外三相更好的清除效果，清除效果小于VC，但大于BHT。

圖3 粗提物對羥基自由基的清除作用

2.2.3 還原力的測定 還原力的測定，是檢驗樣品是否為良好的電子供應者。實驗結果表明，在濃度為400μg/mL時，乙酸乙酯相的還原能力略小于VC，但大于BHT。實驗表明，乙酸乙酯相可能是良好的電子供應者，其供應的電子可使Fe3+還原為Fe2+，也可參與自由基反應，使其成為穩定的物質。

3 結論

3.1 蘆丁濃度在0～50μg/mL范圍內，與吸光度呈現良好的線性關系，楊梅渣粗提物乙酸乙酯相和正丁醇相中總黃酮含量較高，分別為13.0%，6.5%。

3.2 抗氧化實驗結果表明，楊梅渣粗提物對DPPH自由基、羥基自由基的清除效果和還原能力都在一定濃度范圍內呈現濃度依賴性，隨著樣品濃度的增加而增大。楊梅渣粗提物正丁醇相和乙酸乙酯相具有較強的DPPH自由基清除能力，其清除率IC50相應為30、40μg/mL，分別約為VC的3.67倍、2.75倍。

3.3 楊梅渣粗提物對DPPH自由基表現出很強的清除效果，乙酸乙酯相＞正丁醇相＞水相＞石油醚相，這與四個提取相總黃酮含量是呈正相關的。結合清除DPPH自由基能力和還原力來看，楊梅渣提取物正丁醇相和乙酸乙酯相有待進一步分離純化及鑒定，以確定楊梅渣中抗氧化活性成分。

3.4 楊梅渣粗提物表現出良好的抗氧化性，具有廣闊的開發前景，有望通過進一步研究開發純天然的食品抗氧化劑，這對楊梅產業的發展大有裨益。

圖4 粗提物還原力測定

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Research on the extraction and anti-oxidation of flavonoids in Myrica rubra marc

CHEN Xue-li1，YE Li-bin1，LI Jian-rong1，*，SUN Jin-cai2，CHEN Wei1，XU Qing-yan2，Zhou K.3
（1.College of Food Science and Biotechnology Engineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China；2.Zhejiang Haitong Food Group，Cixi 315300，China；3.Department of Food Scienceamp;Technology，Virginia Polytechnic Institute and State University，Blacksburg Virginia 24061，USA）

Myrica rubra is a specific fruit species in China，annual production of which is about 1 million tons，and Myrica rubra marc accounts for 10%of total weight of the fruit.At present，the food industry based on Myrica rubra resources has a certain scale，while the utilization of Myrica rubra marc is still blank.The fractions were acquired from Myrica rubra marc by a series of steps including extraction and concentration，followed by extraction with petroleum ether，ethyl acetate，n-butanol.The anti-oxidative activities of the extracts were evaluated in vitro，including DPPH radical scavenging activity，Fenton action and reducing power methods.The results showed that n-butanol fraction and ethyl acetate fraction of Myrica rubra marc crude extracts exhibited strong scavenging abilities for DPPH free radical，their half-inhibitory concentration（lC50）were 30μg/mL and 40μg/mL，respectively，and were approximately 3.67 times and 2.75 times as much as that of Vitamin C（110μg/mL）.

Myrica rubra marc；total flavonoids；extraction；anti-oxidation

TS201.1

A

1002-0306（2011）02-0085-04

2010-01-08 *通訊聯系人

陳學麗（1985-），女，碩士，研究方向：農產品加工與貯藏。

“十一五”國家科技支撐計劃重點項目（2006BAD27B03）；寧波市農業攻關國際科技合作項目（2008C10042）。