豬源分離大腸埃希菌產ESBLs的基因型及耐藥性分析

劉雅妮，商 軍，郭士博

(1.上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103;2.南京農業大學動物醫學院，南京 210095)

超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)是由質粒編碼的，能通過結合、轉化和轉導形式，造成耐藥基因在細菌間擴散，使敏感菌變成耐藥菌;且產生ESBLs菌耐藥譜廣，表現為多重耐藥，是臨床常見的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌主要耐藥機制［1-2］。隨著獸醫臨床上抗菌藥物的廣泛應用，大腸埃希菌耐藥菌株不斷出現，甚至對多種抗菌藥物同時耐藥的多重耐藥菌株也屢見不鮮，細菌耐藥性的出現和耐藥細菌的感染常使經驗性治療難以奏效，給獸醫臨床抗感染治療帶來極大的挑戰。近年來，由于超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)造成部分β-內酰胺類抗菌藥物臨床失效的情況日益嚴重，對動物和人類的健康造成嚴重威脅，而大腸埃希菌是表示抗菌藥物耐藥性水平的一種指示菌［3-5］，因此有必要對大腸埃希菌的耐藥性和ESBLs基因進行分析和研究。為了解大腸埃希菌超廣譜β-內酰胺酶的檢出率及其耐藥性，指導獸醫臨床合理用藥，對2010年9月-2011年3月從上海地區10個規模化養豬場分離得到的296株大腸埃希菌進行了研究分析。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株，大腸埃希菌，2010年9月-2011年3月從上海地區10個規模化養豬場肛門樣本中分離得到;質控菌株，大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603，美國標準菌種保藏中心;7000熒光PCR擴增儀，美國AB公司;Taqman Mix PCR反應液、引物和探針，上海英駿公司;低溫離心機，德國Beckman公司;VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統及配套細菌鑒定卡(GN卡)，法國生物梅里埃公司;普通營養肉湯、營養瓊脂，北京陸橋技術有限責任公司;麥康凱瓊脂，美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 采樣 以滅菌棉簽拭子采豬肛門作為大腸埃希菌分離，每個養殖場采30～60份拭子樣本，共320份樣本。

1.2.2 菌株分離、純化與鑒定 取拭子樣品用接種棒直接接種于麥康凱瓊脂平面，37℃培養18～24 h，挑取粉紅色、邊緣光滑的大腸埃希菌可疑菌落，用麥康凱培養基純化一代，然后接種于營養瓊脂平面，37℃培養12～24 h。采用生物梅里埃VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統鑒定出296株，分離率為92.5%。

1.2.3 ESBLs確證試驗 采用微量肉湯稀釋法，用頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟三種抗生素進行初篩試驗。以頭孢他啶、頭孢他啶+克拉維酸和頭孢噻肟、頭孢噻肟+克拉維酸這兩種組合進行確證試驗。結果判讀參照美國全國臨床檢驗標準委員會(CLSI M100-S20)推薦的ESBLs表型確證試驗法篩選出產ESBLs大腸埃希菌52株［6］。

1.2.4 藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法，對52株產ESBLs和244株非產ESBLs大腸埃希菌進行5類10種常見獸用抗菌藥物藥敏試驗。按農業部發布的《抗菌藥敏感性試驗操作方法和判斷標準》和CLSI M100-S20標準判斷藥敏結果［6］。

1.2.5 實時熒光PCR擴增 (1)引物設計。分別根據ESBLs的SHV、TEM、CTX-M、OXA編碼基因序列設計引物和探針，所有引物由上海英駿合成(表1);(2)菌液的DNA模板制備。采用傳統的煮沸法提取質粒DNA［7］，挑取新鮮單個菌落溶于100 μL 雙蒸水，煮沸 15 min，10000 r/min，離心 5 min，吸取上清液作為模板液備用;(3)陽性標準菌株制備。將定性PCR擴增出的SHV、TEM、CTX-M、OXA全長序列產物與pMD18-T載體連接，DH5α大腸埃希菌進行轉化;(4)PCR反應體系。Platinum Super Mix 12.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，終濃度為 0.4 μmol/L，Taq Man 探 針 0.3 μL，終 濃 度 為0.24 μmol/L，模板1 μL，雙蒸水補至25 μL;(5)PCR 反應參數。試驗采用兩步法進行。50℃，2 min，激活UNG酶;94℃預變性2 min，激活金牌Taq Man酶，94℃變性30 s，60℃退火1 min，40個循環，所有檢測熒光擴增曲線由7000檢測系統自動生成;(6)擴增產物的克隆及測序。將上述PCR擴增產物回收，克隆測序，并與NCBI基因庫進行序列比較。

表1 ESBLs四種基因型熒光PCR引物和探針的設計

2 結果

2.1 ESBLs的篩選和藥敏試驗結果 按1.2.3 ESBLs確證試驗，采用微量肉湯稀釋法，從296株大腸埃希菌中篩選出52株產ESBLs大腸埃希菌，分離率為17.6%。按1.2.4藥敏試驗，對52株產ESBLs和244株非產ESBLs大腸埃希菌進行10種抗菌藥物的藥敏試驗，試驗結果如表2、圖1所示。試驗結果表明，產ESBLs的大腸埃希菌的耐藥率明顯高于非產ESBLs的大腸埃希菌，且產ESBLs大腸埃希菌組表現為多重耐藥性。耐藥率在90%以上的有氨芐西林、頭孢唑啉和諾氟沙星;70%以上的為復方新諾明和氟苯尼考;60%以上的為頭孢噻呋和卡那霉素;50%以上的為奧格門丁(阿莫西林/克拉維酸)、慶大霉素和達氟沙星。對10種抗菌藥物表現出不同程度的多重耐藥性，主要為7重～10重耐藥。值得關注的是，對頭孢噻呋和諾氟沙星耐藥率，產ESBLs大腸埃希菌顯著性地高于非產ESBLs大腸埃希菌。

表2 52株產ESBLs大腸埃希菌和244株非產ESBLs大腸埃希菌藥敏試驗比較結果

圖1 52株產ESBLs大腸埃希菌和244株非產ESBLs

2.2 產ESBLs大腸埃希菌基因型檢測結果 按1.2.5實時熒光PCR擴增，通過設計四對特異性引物和探針對每株細菌進行了PCR擴增，對確證的52株產ESBLs大腸埃希菌進行基因分型試驗，結果如表3、圖2所示。試驗結果表明，52株細菌中46株攜帶TEM型的基因，占總數的88.5%;15株細菌攜帶CTX-M型基因，占總數的28.8%;11株細菌同時攜帶TEM型和CTX-M型基因，占總數的21.2%;未檢出攜帶 SHV型、OXA型的菌株;2株未檢測到上述四種基因型，可能還存在其他基因型，有待于進一步的研究。

表3 產ESBLs大腸埃希菌PCR擴增產物檢測結果

圖2 TEM基因型和CTX-M基因型ESBLs的PCR反應曲線

3 討論

在分離的296株豬源大腸埃希菌中產ESBLs檢出率為17.6%，對10種抗菌藥物藥敏試驗中，與非產ESBLs大腸埃希菌相比，產ESBLs大腸埃希菌對頭孢唑啉、頭孢噻呋、慶大霉素、諾氟沙星和達氟沙星呈現更高的耐藥性，對動物專用藥物第三代頭孢菌素頭孢噻呋的耐藥率為63.5%，且對10種抗菌藥物表現出不同程度的多重耐藥性，主要為7重～10重耐藥，占88.5%。

在對52株產ESBLs大腸埃希菌基因型分析中，檢出攜帶TEM型、CTX-M型和TEM+CTX-M型ESBLs耐藥基因，沒有檢出攜帶SHV型、OXA型和TEM型+SHV型ESBLs耐藥基因，提示這可能與上海地區規模化豬場使用頭孢菌素類藥物的種類和頻率有關，且規模化豬場產生ESBLs的大腸埃希氏菌未通過質粒進行細菌間耐藥基因的交換。

由于抗生素選擇性壓力的不斷增大，人醫臨床新的超廣譜β-內酰胺酶不斷涌現［8-9］，抑制細菌β-內酰胺酶活性是克服該類細菌耐藥性的有效手段。為防止產ESBLs菌的克隆性傳播，畜禽養殖場應制定有效的消毒隔離措施，并結合藥敏結果，合理應用抗生素，尤其是第三代頭孢菌素，延緩耐藥菌株的產生，輪換使用抗生素，對控制產ESBLs菌株的感染將起到十分重要的作用。

［1］Livermore D M，Brown D F.Detection of β -lactamase Mediated Resistance［J］.J Antimicrob Chemother，2001，35:281-294.

［2］Winokur P L，Canton R，Casellas J M，et al.Variations in the Prevalence of Strains Expressing an Extended-spectrum βlactamase Phenotype and Characterization of Isolates from Europe，the Americas，and the Western Pacific Region［J］.Clin Infect Dis，2001，32(Suppl.2):S94-S103.

［3］Alessandra C，Aurora G F，Paola V，et al.Molecular Epidemiology of Escherichia coli Producing Extended-spectrum β-Lactamases Isolated in Rome，Italy［J］.J Clin Microb，2008，46(1):103-108.

［4］胡功政，匡秀華，苑 麗，等.產ESBLs雞腸桿菌科細菌對21種抗菌藥的敏感性檢測［J］.中國人獸共患病學報，2006，22(9):884-887.

［5］袁正泉，朱劍君，張國富，等.產超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌的基因型檢測及耐藥性分析［J］.實用預防醫學，2006，13(3):579-581.

［6］Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI).Performance Standards forAntimicrobialSusceptibility Testing:Twentieth Informational Supplement［S］.Clinical and Laboratory Standards Institute，2008，M100-S20.

［7］ 薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆試驗指南(下冊)［M］.北京:科學出版社，2005:1713-1726.

［8］Pitout J D，Gregson D B，Church D L，et al.Community – Wide Outbreaks of Clonally Related CTX-M-14 β-lactamase-Producing Escherichia coli Strains in the Calgary Health Region［J］.Clin Microbiol，2005，43(6):2844.

［9］Vignoli R，Varela G，Mota M I，et al.Enteropathogenic Escherichia coli Strains Carring Genes Encoding the PER-2 and TEM-116 Extended-Spectrum β-lactamase Isolated from Children with Diarrhea in Uruguay［J］.J Clin Microbiol，2005，43(6):2940.