湖南省泡狀帶絳蟲線粒體nad1基因的序列測定及分析

伍慧蘭

(湖南第一師范學院，湖南長沙410205)

湖南省泡狀帶絳蟲線粒體nad1基因的序列測定及分析

伍慧蘭

(湖南第一師范學院，湖南長沙410205)

以從我國湖南長沙和湘西犬小腸中采集的2條泡狀帶絳蟲作為研究對象，用引物JB11及JB12擴增泡狀帶絳蟲的pnad1片段，應用C lustalX 1.81程序對序列進行比對，同時利用DNAstar5.0中的Megalign程序進行同源性分析。結果顯示來自湖南長沙和湘西的2條泡狀帶絳蟲的pnad1序列均為391bp。研究結果為泡狀帶絳蟲進一步的分類、鑒定和遺傳變異研究奠定了基礎。

泡狀帶絳蟲；線粒體DNA；nad1基因；序列分析

泡狀帶絳蟲（Taeniahydatigena）寄生于犬、狼和狐貍等動物的小腸內。絳期幼蟲（細頸囊尾蚴，Cysticercus tenuicollis）寄生于豬、綿羊、山羊的肝臟漿膜、大網膜、腸系膜、肝、肺等處，對幼齡動物危害極大，偶爾也可感染人[1-2]。因此，正確鑒定泡狀帶絳蟲，對預防和控制該病的發生具有重要意義。線粒體基因組具有結構簡單、母系遺傳、缺少重組、進化速率快等特點，特別適合作為遺傳學研究的標記[3-5]。本研究以采自湖南長沙和湘西地區犬小腸中的泡狀帶絳蟲為研究對象，對其nad1基因的部分序列(pnad1)進行PCR擴增和序列分析，旨在為泡狀帶絳蟲的分類、鑒別診斷以及本病的防治等研究提供依據。

一、材料與方法

（一）材料

1.蟲體樣品：本研究所用的泡狀帶絳蟲樣品采自湖南長沙(CSTY1)和湖南湘西(XXTY1)。

2.主要試劑：Taq酶（大連寶生物公司產品），蛋白酶K（Merck公司產品）。WizardTMDNA Clean-up System（Promega公司產品）、PCR 試劑（Buffer、MgCl2、dNTPs）為大連寶生物公司產品。

3.樣品DNA的制備：從70%酒精保存液中取出單個蟲體，置于1.5mL Eppendorf管中。按照Promega公司基因組DNA提取試劑盒（Wizard SV Genomic DNA Purification System）的使用說明書提取泡狀帶絳蟲基因組DNA，將提取的基因組DNA置于﹣20℃保存備用。

（二）方法

1.PCR擴增用Bowles[6]等報道的引物JB10和JB11來擴增線粒體pnad1，其序列為：JB11：5'-AGATTCGTAAGGGGCCTAATA-3' 和 JB12：5'-ACCACTAACTAATTCACTTTC-3'。引物由上海生工生物技術有限公司進行合成。反應體系為25μL，其中10×PCR buffer2.5 μL；MgCl2 4 μL；dNTPs（25mM）2 μL；Primer（50 pmol/μL）0.25 μL；Taq polymerase（5 U/μL）0.25 μL；雙蒸水 14.75 μL；模板 DNA 1 μL。擴增條件為：94℃預變性5min，然后94℃變性30 s，55℃退火 30 s，2℃延伸 30 s，共 37個循環，最后 72℃后延伸5min。取2μLPCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠染色，紫外投射儀下觀察結果，凝膠成像系統攝像。PCR產物保存備用。

2.測序：將PCR產物送上海生工生物技術有限公司測序，然后進行序列比較和分析。

3.nad1基因序列測定及其在種系發育分析中的應用：將PCR產物送上海生工生物技術有限公司直接測序，測序結果用DNAstar 5.0軟件進行分析。從GenBankTM檢索現有帶科絳蟲nad1序列（表1），然后與之進行相似性比對和帶科絳蟲種系發育分析。利用Clustal X1.81及Mega 4.0軟件對獲得的CSTY1、XXTY1和GenBankTM的泡狀帶絳蟲nad1基因序列進行比對及計算遺傳距離，然后用Phylip 3.67程序中的最大簡約法 (Maximum parasimony，MP)繪制種系發育樹，以豬蛔蟲Ascaris suum（AS）為外群。最大簡約法采用Branch and bound模型分析，采用自展檢驗(bootstrap test)估算所構建系統樹的可靠性，復制數均為1000。同時利用DNAstar 5.0中的Megalign程序進行相似性分析。

表1 不同帶科絳蟲的nai1序列信息

二、結果

（一）PCR擴增結果

2個泡狀帶絳蟲樣品均成功地擴增出約450 bp的pnad1，與預期目的片段長度相符，且無非特異性條帶，空白對照為陰性，PCR產物電泳圖見圖1。

（二）測序結果及分析

2個樣品pnad1堿基序列長度相同，均為433bp，剔除引物后，均得到391bp的序列。A+T的含量分別為 72.38﹪(CSTY1)和 72.12﹪(XXTY1)，樣品序列與GenBankTM收錄的泡狀帶絳蟲成蟲的相應序列(pnad1登錄號為GQ228819)進行比較，經DNAstar 5.0的MegAlign軟件分析顯示，兩個蟲株的pnad1測序結果與該序列變異的序列的變異堿基數皆小于4，湘西分離株的變異率為0.5﹪和長沙分離株的變異率為0.2﹪。進一步對本研究所測泡狀帶絳蟲pnad1序列之間進行分析，發現湘西分離株和長沙分離株泡狀帶絳蟲序列僅側在存在著1個基因位點變異。中核苷酸序列表現為第148位堿基“A→G”的轉變)（見圖2），證明泡狀帶絳蟲nad1基因的部分序列pnad1種內高度保守，兩地的泡狀帶絳蟲在pnad1序列存在的微小差異可認為是地理差異。

（三）nad1基因序列系統發生樹

采用MP法建樹方法構建的系統發生樹(圖3)顯示，湖南長沙分離株和湖南湘西分離株具有高度同源性，與GenBankTM中報道的泡狀帶絳蟲位于同一分枝，系統發生樹中的Bootstrap值分別在96%以上，2個分離株所屬分枝與其他帶科所屬分支相隔較遠。

三、討論

為了有效診斷、治療和控制寄生蟲病，有必要對寄生蟲蟲株作精確的鑒定和分類。對寄生蟲蟲種及其變種的進化史及分類學上關系方面的認識，不僅具有學術上的價值，而且為今后的研究和控制寄生蟲病提供重要的資料。與核基因組DNA相比，線粒體具有相對分子量小、結構簡單、進化速度快、母性遺傳、無組織特異性等特點。線粒體基因間不發生重組，可以反映出母系的進化歷史，這樣線粒體一個基因就可以代表整個線粒體基因組的變異情況。mtDNA作為一種核外遺傳物質，也正是由于mtDNA的這些特點，使之成為研究寄生蟲系統進化的一種很好的分子標記[7]。在絳蟲的分類鑒定和群體遺傳方面，許多學者研究認為，線粒體基因序列是理想的遺傳標記[8-9]。

本研究應用PCR技術對采自湖南長沙和湘西地區的泡狀帶絳蟲樣品的線粒體DNAnad1基因的部分序列（pnad1）進行了分析，并與GenBank報道的泡狀帶絳蟲成蟲的pnad1序列進行了比較。結果發現，來自中國青海省的泡狀帶絳蟲成蟲和湖南長沙、湘西地區犬小腸中的泡狀帶絳蟲的pnad1的序列存在3個堿基的差異，而湖南長沙和湘西的2個樣品泡狀帶絳蟲的pnad1的序列僅存在1個堿基差異，這種微小差異可以認為是地理差異。采用最大簡約法構建的進化樹顯示出湖南分離株與Taenia hydatigena位于同一分枝高度同源，湖南分離株所屬分枝與其他絳蟲所屬分枝相隔較遠。本試驗PCR擴增了泡狀帶絳蟲pnad1序列并進行了序列分析，為泡狀帶絳蟲的分子分類學和分子遺傳學的進一步研究提供了初步依據。

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SequenceMeasurementand AnalysisofMitochondrialNADH Dehydrogenase Subunit1 ofTaeniaHydatigenaCollected from Hunan Province

WU Hui-lan

(Hunan FirstNormalUniversity,Changsha,Hunan 410205)

To analyze them itochondrialNADH dehydrogenase subunit1(nad1)gene ofTaeniahydatigena collected from Hunan province,one should follow the three steps.Firstly,the partialnad1(pnad1)isamplified from eachTaeniahydatigenasample.Thenpnad1sequencesare aligned by using the ClustalX 1.81.Lastly,sequence homology analysis isconducted by using the Megalign program of the software DNAStar version 5.0.The result shows that the length ofpnad1is 391bp.This result has provided a foundation for further studies ofmolecular identification and moleculargeneticsofTaeniahydatigena.

taeniahydatigena；MitochondrialDNA；nad1 gene；sequence analysis

R383.3

A

1674-831X（2011）04-0137-05

2011-04-12

湖南第一師范學院院級課題（XY10N 01)

伍慧蘭（1962—），女，湖南郴州人，湖南第一師范學院教師，主要從事生物實驗教學工作。

[責任編輯：胡 偉]