運動訓練對自發性高血壓大鼠心肌細胞凋亡蛋白表達的影響

馮 立

（上海體育職業學院，上海 200237）

運動訓練對自發性高血壓大鼠心肌細胞凋亡蛋白表達的影響

馮 立

（上海體育職業學院，上海 200237）

目的：研究運動訓練對SHR心肌細胞中HSP－72、Bcl－2和蛋白激酶β（PKB）、Bax、糖原合成激酶－3（GSK－3）的影響，以探討其對運動引起心肌細胞凋亡的作用。方法：以SHR大鼠中等強度訓練為實驗模型，采用Western bloting技術檢測了大鼠心肌細胞中調控蛋白HSP－72、Bcl－2和蛋白激酶β（PKB）、Bax、糖原合成激酶－3（GSK－3）的表達。結果：長期中等強度訓練可以提高心肌細胞中抑凋亡蛋白HSP－72、Bcl－2和蛋白激酶β（PKB）的表達，凋亡蛋白Bax、糖原合成激酶－3（GSK－3）表達顯著降低，Bcl－2／Bax的表達沒有顯著變化，從而抑制心肌細胞的凋亡。結論：心肌細胞中HSP－72、Bcl－2和蛋白激酶β（PKB）、Bax、糖原合成激酶－3（GSK－3），Bcl－2／Bax在運動后的不同表達對心肌細胞凋亡的發生有明顯的抑制作用。

Bax；Bcl－2；血壓；糖原合酶－3；心臟；HSP－72；蛋白激酶－β；自發性高血壓大鼠

運動訓練是降低高血壓的有效的非藥理學方法。大量研究結果表明，長期中等強度的有氧訓練可以使收縮壓平均降低11mmHg（5－25mmHg），舒張壓平均降低8mmHg（3－15）［1］。運動訓練可以防止心肌線粒體不成比例的增長，防止肥大心臟左心室心肌膠原纖維的不成比例的增長［2］。心肌細胞的凋亡在血壓升高的加速期以及高血壓向心衰期過度時期，對于心肌細胞的重塑起到了非常重要的作用［3］。調控細胞凋亡的蛋白包括熱休克蛋白72（HSP－72）和Bcl－2蛋白家族，抑凋亡蛋白Bcl－2和凋亡前蛋白Bax是高血壓大鼠心肌細胞凋亡過程中心肌線粒體功能的主要調節者［45］。

研究表明，運動訓練對于凋亡通路的影響作用都涉及到胰島素抵抗和細胞凋亡。而絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶β，肝糖原合成激酶β，在自發性高血壓大鼠還有待研究［6］。既往研究表明，通過運動訓練可以使糖尿病大鼠左心室PKB、GSK－3v殘基磷酸化水平明顯下降并且恢復到正常水平［7］。PKB抑制凋亡級聯，是通過Bcl－2家族前凋亡蛋白Bad的失活、Bcl－2蛋白和PKB的磷酸化使線粒體轉換空關閉以及蛋白激酶β促進葡萄糖和氨基酸的吸收，從而導致蛋白的合成和GSK－3的失活實現的。而GSK－3又是PKB下游重要的靶點，它的失活將會促進糖原的合成并且提供一個可能促凋亡的機制［8］。GSK－3在跑臺訓練大鼠的骨骼肌中并沒有被胰島素激活。研究表明，自發性高血壓大鼠在4周齡的時候，平均動脈壓開始上升，而運動訓練對這個時期大鼠的心功能和血壓都有有益的影響［9］。并且發現凋亡前蛋白表達升高以及病理性心臟重塑［10］。有關運動對心肌細胞中PKB／GSK－3通路、抑凋亡元素HSP－72、Bcl－2以及凋亡蛋白Bax的影響，國內外尚沒有較全面的報道。本實驗試圖研究運動對心肌細胞中PKB／GSK－3通路、抑凋亡元素HSP－72、Bcl－2以及凋亡蛋白Bax的影響，以探討凋亡調控基因對運動引起心肌細胞凋亡的作用，為進一步研究運動性疲勞的機制提供理論依據。

1 實驗材料和方法

1．1 實驗動物

14只遺傳性自發性高血壓雄性大鼠，3周齡，常規分籠喂養，自然光照，飼養環境溫度（23±4）℃，自由飲水進食（自發性高血壓大鼠血壓升高的加速期在4～9周齡期間，因此，建立13周動物模型）［11］。

1．2 分組和訓練方法

大鼠購進后，先適應性喂養2天，稱重后隨機分成2組，運動組（8只）和安靜組（6只），SHR大鼠每周訓練5天，周一至周五，跑臺訓練8周，在第4周開始訓練。適應期每分鐘15m，每天15min，適應期后每分鐘18m，每天120min［11］。

1．3 實驗方法

1．3．1 每周血壓的測定 安靜狀態下每周記錄大鼠的收縮壓，從第2周到第8周，在第5周的時候，在訓練后1、3、12小時后補測3次，用來檢測訓練對大鼠收縮壓的急性影響。

1．3．2 樣本采集 各組大鼠斷頭處死后，迅速取出心臟洗盡殘血，取心室肌。對照組也以同樣方法收集標本。

1．3．3 骨骼肌細胞色素C氧化酶和心肌糖原含量 左心室糖原濃度測定用分光光度計來測定。骨骼肌細胞色素C氧化酶活性，被常用來驗證訓練效果的重要的標記物。細胞色素氧化酶的測定通過分光光度計測定［11］。

1．3．4 勻漿和樣品制備 取左心室前壁全層心肌組織，分兩份，一份即刻存至－70℃冰箱，用作免疫印跡檢測；一份用4%多聚甲醛固定24h后蔗糖沉淀過夜，取左心室近心尖處心肌組織作10um厚冰凍切片，每個標本取兩張不連續切片，用作TUNEL檢測。將左室心肌及骨骼肌剪成碎片，以針頭輕輕劃碎。清洗3次；15min后棄上清，以含0．6mmoL／L CaCl2的無鈣K－H液清洗沉降細胞；10min后以含1．0mmoL／L CaCI，的無鈣K—H液清洗沉降細胞后備用［12］。

1．3．5 免疫印跡法檢測心肌組織中Bax、Bcl2、PKB的表達

①蛋白樣品的制備：取凍存的心肌標本100mg，加裂解液1 ml及PMSF，protcase inhibitor cocktail，phosphatase inhibitor cocktail各10μl，冰上勻漿30min，4℃12 000r／min離心15min，取上清，測定蛋白濃度后與等體積2×上樣緩沖液混勻后煮沸3min，－20℃保存以備用。②免疫印跡：按照實驗室常規方法配制10%SDS—PAGE，以總蛋白量30ug／lane上樣，電泳；轉膜，以1∶400鼠抗bax單克隆抗體或1∶400鼠抗Bcl－2單克隆抗體及1∶5000辣根過氧化物酶標羊抗鼠IgG孵育，用ECL發光劑顯示陽性條帶，在Ty2phoon分子成像系統上記錄結果。以β－actin為內參照，目標蛋白條帶及β－actin條帶為同次電泳所得，以兩者的比值進行半定量［13］。

1．3．6 數理統計法 使用SPSS 17．0統計軟件，實驗數據采用均數±標準差，采用單因素方差分析進行統計學處理，組間比較采用T檢驗，相關性的評價采用皮爾遜積差測試。結果顯著程度用P＜0．05表示。

2 結果與分析

2．1 血壓和左心室功能

SHR在訓練過程中收縮壓和舒張壓在第6周之前顯著上升，而訓練方式對血壓的變化沒有顯著性影響（圖1）。相反，訓練后麻醉狀態下大鼠收縮壓和舒張壓升高的更高，與安靜組比較（表1）。心率和壓力最大速率以及舒張最大速率訓練組和運動組差異沒有顯著性（表1）。雖然訓練對高血壓大鼠的平均動脈壓沒有長期影響，但卻有急性的影響。在第5周訓練期間，血壓在訓練后3～12h下降明顯。

圖1 訓練對血壓的影響

表1 訓練組大鼠和安靜組大鼠各項生理指標的比較

訓練組大鼠與安靜組大鼠相比，訓練對SHR心臟以及跖肌重量、骨骼肌細胞氧化酶的活性以及心肌糖原含量的變化影響表現為心臟重量的變化差異沒有顯著性，但是HW／BW顯著升高（表1）。同樣，跖肌重量變化差異沒有顯著性，而跖肌重量與體重（P／BW）相比卻顯著升高（表1）。訓練組大鼠跖肌細胞色素氧化酶的活性顯著增強，心肌糖原的濃度增加了39%（圖3），GSK－3β、PKB－Ser473的磷酸化，PKB下游重要的靶點沒有顯著的變化。然而，GSK－3β、PKBSer473的磷酸化與PKB Thr308和PKB－Ser473的磷酸化密切相關（（r＝0．60and 0．58，P＜0．05）。

圖2 訓練結束1、3、12h后大鼠血壓變化、訓練前后血壓的變化

圖3A 訓練組以及安靜組大鼠蛋白激酶β的變化，蛋白質印跡分析蛋白激酶的表達，PKB Thr308 and Ser473的磷酸化

圖3B 訓練組和安靜組大鼠蛋白激酶β磷酸化的比較

2．2 訓練對高血壓大鼠左心室HSP72以及Bcl－2／Bax蛋白表達的影響

與安靜組相比較，訓練組大鼠Bax的表達下降了91%。Bcl－2蛋白的表達升高了106%（圖4），訓練組大鼠與安靜組大鼠Bcl－2／Bax差異沒有顯著性；與安靜組相比，訓練組大鼠HSP72蛋白的表達升高了71%。

圖4A 訓練組大鼠和安靜組大鼠Bcl－2，Bax變化的比較。A Western blotting檢測Bcl－2，Bax蛋白表達的結果

圖4B 兩組大鼠Bcl－2，Bax蛋白表達變化結果

3 分析與討論

由于自發性高血壓大鼠的血壓在第4周的時候顯著增加，驗證了在這個時間點上運動訓練對血壓的影響，以及心功能、線粒體功能相關的蛋白的表達，以及心肌細胞的存活［14］。長時間的跑臺訓練對心肌的適應性以及蛋白的表達具有非常明顯的影響［15］。

本研究中，長期的跑臺訓練在大鼠血壓的急速升高期并沒有下降，相反表現出升高的趨勢。大量研究表明，耐力訓練可以降低高血壓患者的血壓。然而許多研究就耐力訓練對自發性高血壓大鼠血壓的影響報道不一致［16－17］。許多研究者采用跑臺訓練、游泳訓練和跑輪訓練模型，研究運動訓練對大鼠血壓的影響。有的學者研究結果表明運動訓練對血壓的升高有明顯的影響，而有的研究結果表明對血壓的影響有降低的趨勢，而有的研究結果則表明沒有明顯的差別［18］。這些研究結果的差異可能與運動強度、運動時間、運動模型、應激以及環境因素的影響有關。并且，訓練對大鼠血壓升高的機制還不清楚。有學者研究認為，在訓練的刺激下，去甲腎上腺素分泌升高可能是其中的原因之一［19］。相比之下，很多學者研究表明低強度的運動訓練可以降低SHR的收縮壓、舒張壓、平均動脈壓［20］。

國外學者研究結果表明，低強度訓練引起血壓下降，高強度運動訓練引起血壓升高可能與心率的變化有密切的關系，而心率的變化與交感神經緊張性有密切的聯系，它使心輸出量降低而不改變外周阻力［21－22］。這些研究結果與我們的研究相比較發現，兩種運動模型的運動速度相似，但我們的運動模型運動持續時間較短。一個可能的原因就是在訓練的條件下應激的影響可能是血壓升高的一個因素。實際上，在對SHR進行跑臺訓練的過程中，電刺激的作用對大鼠血壓的變化就是一個很大的影響因素。然而，在一個星期之后，我們通過對SHR大鼠的血壓的測定，結果發現，SHR的血壓組間并沒有顯著的差異。在對電刺激對SHR的影響進行嚴格的控制后，我們發現麻醉狀態對運動大鼠的血壓的影響也是一個重要的因素。因此，訓練時間可以對血壓變化的影響加以解釋。事實上，訓練大鼠的血壓在3～12小時時候就開始下降，表明訓練的形式對血壓的下降有明顯的影響，雖然運動訓練對血壓影響不是長期的。

運動訓練和高血壓誘導的生理性和病理性心肌肥厚模型都是心臟對血流動力學超負荷的反應。生理性心臟肥大對心功能是有益的，而病理性心肌肥厚對心功能的影響是負面的。在我們的實驗模型中，訓練并沒有進一步增加心臟的肥大程度［23］。與安靜組比較，訓練組SHR左心室收縮指數沒有顯著的變化，因此，長期的運動訓練對SHR心功能并沒有產生影響，盡管有證據表明訓練可以提高骨骼肌細胞色素氧化酶的活性。研究表明，運動訓練對心臟的功能、線粒體、糖原具有許多良好的影響［24］。研究結果表明，訓練組SHRPKB磷酸化的程度顯著升高，PKB的磷酸化與GSK－3βSer9的磷酸化密切相聯系。

細胞凋亡在SHR血壓增加期向心力衰竭過度期在心臟的重塑過程中起到非常關鍵的作用，我們檢測了訓練后Bax和Bcl－2蛋白的表達，SHR心肌層抑凋亡蛋白Bcl－2和Bax的比率顯著降低，從而誘導心肌細胞的凋亡，實驗結果表明，運動訓練并沒有改變Bcl－2／Bax，但是，安靜組與運動組SHR大鼠相比，Bcl－2和Bax的表達都升高了，訓練組SHR心肌層Bax蛋白表達的升高可能與較低的糖原濃度以及慢性血壓的升高導致心臟負荷增加有關。糖原的濃度在訓練結束后48h仍保持很低的濃度，SHR心臟胰島素抵抗以及脂肪酸氧化的損傷，更說明了糖原濃度的重要作用。

國外學者研究發現糖原濃度的降低會導致Bax結構染色體畸變［25］。在本研究中，還不清楚Bax表達的升高是否是因為Bax從胞漿轉移到線粒體。然而，Bcl－2的表達升高仍然是一個保護性機制，在線粒體的外膜阻止Bax的寡居化從而降低Bax結構染色體畸變。HSPS抗凋亡的作用機制獨立于Bcl－2，HSP70通過阻止半光天冬酶的水解來阻止壓力誘導的細胞凋亡，此外，HSP72通過阻止GSK－3β在細胞核的集聚來抑制細胞的凋亡。以前的研究表明，正常血壓大鼠訓練后心肌層HSP72mRNA表達顯著升高，同樣，HSP72蛋白在訓練后SHR心肌層表達明顯升高。運動訓練后大鼠心肌層HSP72表達顯著升高的機制還不清楚［26］。但是，HSP72表達的升高支持了運動訓練有益于抑制細胞凋亡的通路，從而保護心肌層。

4 結論

細胞凋亡是一個高度調控的過程，主要通過死亡受體和線粒體兩條途徑進行。心肌細胞的凋亡在心臟疾病中的作用是不容忽視的。目前各種生活方式疾病——高血壓、糖尿病、肥胖等都直接或間接與心臟的受累相關。導致其死亡率增加。而運動可能通過調節氧化應激、上調HSP蛋白的表達和激活PKB等途徑調控心肌凋亡，包括心肌層PKB和HSP－72通路；抗凋亡蛋白HSP－72和Bcl－2的表達的增加。但是運動訓練沒有提高Bcl2／Bax，提示在SHR心肌抗凋亡機制有效地代償了促凋亡基因的表達?？傊?，心肌細胞中凋亡調控蛋白Bcl－2、Bax和HSP－72，PKB，GSK－3在運動后的不同表達對心肌細胞凋亡的發生有明顯的調控作用。

［1］梁 崎，王于領，孫 冰．中年人運動中及恢復期血壓變化及其與血漿一氧化氮的關系［J］．中華物理醫學與康復雜志，2007，29（3）：149－153．

［2］蔡 秋，王 翔，王步標．耐力訓練性與病理性心臟肥大對心肌超微結構影響的比較研究［J］．廣州體育學院學報，2001，21（2）：28－31．

［3］孟雋卿，鄧樹勛．遞增負荷運動對心肌細胞凋亡調控基因表達的影響［J］．天津體育學院學報，2009，24（3）：261－264．

［4］Miyashita T，Reed JC．Tumor suppressor p53is a direct transcriptional activator of the human Bax gene［J］．Cell，1995，80（2）：293－299．

［5］Adams JM，Cory S．Life－or－death decisions by the Bcl－2protein family［J］．Trends Biochem Sci，2001，26（1）：61－66．

［6］李 欣，盧 健，吳 薇．長期有氧運動對心肌細胞凋亡的影響［J］．綿陽師范學院學報，2009，28（11）：110－114．

［7］李明學，程珂玲，金 雯．有氧運動對衰老模型大鼠心肌細胞凋亡及Bcl－2和Bax蛋白表達的影響［J］．中國老年學雜志，2009，29（4）：950－952．

［8］招少楓，江鐘立．心肌細胞凋亡與運動調控［J］．中國康復醫學雜志，2006，21（4）：372－375．

［9］方 力，王燁菁，付朝偉．高血壓運動干預中長期效果影響因素定性研究［J］．中國全科醫學，2006，15（8）：221－223．

［10］張 赟，戴翠蓮．泛素－蛋白酶體系統在心肌梗死中的病理生理意義［J］．中國病理生理雜志，2010，11（6）：339－345．

［11］竇 麗，張 均．有氧運動對高血壓大鼠血壓和血漿PGI2／TXA2系統的影響［J］．西安體育學院學報，2008，25（2）：76－80．

［12］李保良，趙曉山，羅 仁．亞健康疲勞狀態時血清對骨骼肌細胞線粒體膜細胞色素C氧化酶活性和線粒體能量負荷的影響［J］．中國病理生理雜志，2008，37（12）：1234－1236．

［13］李 曉，姜 萍，姜月華，等．通心絡對糖尿病大鼠心肌微血管炎癥損傷及血管痙攣的防治作用［J］．中國老年學雜志，2010，37（12）：234－236．

［14］王鵬軍張昱馮加純，等．IGF－1對Aβ25－35致PC12細胞損傷的保護作用及其機制的探討［J］．中國老年學雜志，2010，37（12）：234－236．

［15］Suwaidi JA，Hamasaki S，Higano ST，et al．Long term follow－up of patient with mild coronary artery diaease endothelial dysfunction［J］．Circulation，2000，101（9）：948－954．

［16］Zukowska Z，Grant DS，Lee EW．Neuropeptide Y：a novel mechanism for ischemic angiogenesis［J］．Trends Cardiovasc Med，2003，13（2）：86－92．

［17］王超英．細胞凋亡（Apoptosis）生化［J］．杭州師范學院學報，2000（3）：45．

［18］楊麗娟．線粒體與細胞凋亡［J］．通化師范學院學報，2005（2）：24．

［19］熊國勝，徐美琴．不同強度運動對大鼠淋巴細胞凋亡的影響［J］．江西師范大學學報（自然科學版），2006（6）：75．

［20］湯長發，周 婕．運動與細胞凋亡［J］．北京體育大學學報，2004（1）：24．

［21］李 欣，丁樹哲，盧 ?。棺栌柧殞λダ闲∈笮募arcopenia中Akt／mTOR信號通路的影響［J］．天津體育學院學報，2009（4）：20．

［22］Peterson J M，Bryner R W，Sindler A，et al．Mitochondrial apoptotic signaling is elevated in cardiac but not skeletal muscle in the obese Zucker rat and is reduced with aerobic exercise［J］．J Appl Physiol，2008，105（6）：1934－1943．

［23］李 欣，盧 健，趙宏陽．長期有氧運動對心肌sarcopenia中細胞凋亡的影響［J］．西安體育學院學報，2009（6）：72．

［24］Adam V，Jiang H，Yu J，et al．Apoptosis in skeletal myocytes of patients with chronic heart failure is associated with exercise intolerance［J］．J Am Coll Cardiol，1999，33（4）：959－965．

［25］張 鈞，許豪文，楊小英．運動對心肌線粒體鈣和細胞色素C的影響［J］．體育科學，2003，23（2）：130－133．

［26］von Harsdorf R，Li PF，Dietz R．Signaling pathways in reactive oxygen species－induced cardiomyocyte apoptosis［J］．Circulation，1999，99（22）：2934－2941．

［27］Thomas DP，Marshall KI．Effects of repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrane structures［J］．Int J Sports Med，1988，9（4）：257－260．

Exercise Training Influence on Myocardial Apoptosis of Spontaneously Hypertensive Rat’s Protein Expression

FENG Li（Shanghai Sports Institute，Shanghai 200237，China）

Objective：To study exercise training on SHR cardiomyocytes HSP－72，Bcl－2 and protein kinaseβ（PKB），Bax、Bcl－2，glycogen synthase kinase－3（GSK－3）to investigate its effect on exercise－induced myocardial cell apoptosis．Methods：taking SHR rats as the experimental model of moderate－intensity training，detected by Western bloting a regulatory protein in rat heart cells HSP－72，Bcl－2 and protein kinaseβ（PKB），Bax、glycogen synthase kinase－3（GSK－3）expression．Results：Long－term moderate intensity training can improve myocardial cells antiapoptotic protein HSP－72，Bcl－2 and protein kinaseβ（PKB）expression，Bax、glycogen synthase kinase－3（GSK－3）was significantly decreased，Bcl－2／Bax expression did not change significantly，thereby inhibiting apoptosis of myocardial cells．Conclusion：Different expression of Myocardial cells of HSP－72，Bcl－2 and protein kinaseΒβ（PKB），Bax、glycogen synthase kinase－3（GSK－3），Bcl－2／Bax expression arfter exercise has significantly inhibited on myocardial cell apoptosis．

Bax；Bcl－2；blood pressure；glycogen synthase－3；heart；HSP－72；protein kinase－β；spontaneously hypertensive rats

G804．5

A

1004－0560（2011）03－0064－04

2011－03－15；

2011－04－25

馮 立（1976－），男，講師，碩士，主要研究方向為運動醫學。

喬艷春

?運動人體科學