硝酸鑭對大鼠免疫功能的影響

劉小陽，胡愛武

(1.宿州學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)系，安徽，宿州 234000;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233000）

硝酸鑭對大鼠免疫功能的影響

劉小陽1,2，胡愛武2

(1.宿州學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)系，安徽，宿州 234000;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233000）

目的 探討硝酸鑭對大鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、紅細(xì)胞免疫和巨噬細(xì)胞活性等免疫功能的影響。方法SD雄性大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組I、II、III和CK組，每組16只。實(shí)驗(yàn)I、II、III組每天分別灌飼1次劑量為0.1，2，20 mg/kg體重的硝酸鑭溶液。CK組灌飼生理鹽水。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)I組RC3bRR為4.74%±1.63%明顯高于CK組3.16±1.21（P＜0.05)，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率也有明顯變化（上升），腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性呈上升趨勢，但均未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)II組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、RC3bRR及其腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性均顯著高于CK組（P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)III組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、RC3bRR和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性均低于CK組，但均未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。結(jié)論 硝酸鑭對大鼠免疫功能有明顯影響，低劑量時(shí)能提高其免疫能力，高劑量時(shí)則抑制其免疫能力。

鑭；淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率；紅細(xì)胞免疫；巨噬細(xì)胞活性

稀土飼料添加劑在養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用已得到公認(rèn)。在畜禽飼料中摻加一定劑量的稀土飼料添加劑，可提高畜禽的生長性能，降低死亡率，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等[1]。有研究表明，在肉雞飼料中添加一定劑量的混合稀土，不僅提高日增重，而且還降低死亡率[2]；在生長豬的飼料中添加氯化鑭（100mg/kg）或氧化稀土（75mg/kg），生長豬的采食量增加，日增重提高13.6%(P<0.05)，飼料轉(zhuǎn)化率提高6.53%(P<0.05)[3,4]；在綿羊的飼料添加有機(jī)稀土，日增重和毛長都有增加[5]。涂序珉等研究了檸檬酸鈰對受射線照射的小鼠自然殺傷細(xì)胞（NK）活性的影響，發(fā)現(xiàn)一定劑量檸檬酸鈰能提高小鼠NK的活性，增強(qiáng)免疫能力[6]。王宗惠等證實(shí)機(jī)體攝入6~250 g/mL范圍內(nèi)的稀土元素能提高巨噬細(xì)胞活性，增強(qiáng)其特異性呑噬功能，并與稀土的劑量呈一定的依賴關(guān)系[7]。本實(shí)驗(yàn)用不同劑量的硝酸鑭分短期和長期連續(xù)飼喂大鼠，測定外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率（RC3bRR）和巨噬細(xì)胞吞噬活性的變化，研究硝酸鑭對大鼠免疫機(jī)能的影響，一方面為稀土生物效應(yīng)的機(jī)理研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，另一面為稀土在養(yǎng)殖業(yè)更廣泛的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和主要設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)材料為安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的40日齡生長期雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，共 64只。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 硝酸鑭（淄博偉杰稀土有限公司提供），1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司提供），小牛血清（杭州四季青生物材料研究所提供），氚標(biāo)胸腺嘧啶（中國原子能研究所提供），D-Hank’s液（上海生工公司提供），刀豆蛋白A(上海生工公司提供)，閃爍液，四甲基偶氮唑鹽(MTT)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司提供)，瑞氏染液。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱 （Napco-6100型，美國杜邦公司提供），超凈工作臺(tái)（YJ-1450型，蘇州凈化設(shè)備儀器廠提供），紫外分光光度計(jì)（UV-755B型，上海光譜儀器有限公司提供），倒置型系統(tǒng)顯微鏡（IX70型，日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社提供），液體閃爍計(jì)數(shù)儀（LS-6500型，美國貝克曼公司提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 40日齡生長期雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠64只，籠養(yǎng)，基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由采食和飲水，室溫20℃～25℃，12h晝夜交替。生理鹽水預(yù)飼1周（每天飼喂1次，每次2ml）后，分組、編號(hào)和稱重，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組I、實(shí)驗(yàn)組II、實(shí)驗(yàn)組III和CK組，每組16只。CK組繼續(xù)灌飼生理鹽水，劑 量 不 變 ； 實(shí) 驗(yàn) 組 I、II、III灌 飼 劑 量 依 次 為0.1，2，20mg/kg體重的硝酸鑭溶液， 每只 2ml，1次/d。10d后各組處死一半（共32只），測定外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率（RC3bRR）和巨噬細(xì)胞吞噬活性的變化，做短期研究；30d后處死剩下的一半，測定相同指標(biāo)，做長期研究。

1.2.2 樣品采集與處理

（1）血液：采用無菌心臟取血，用肝素鈉作為抗凝劑，析出血清后儲(chǔ)存于冰箱（4℃），用于外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和紅細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)。

（2）巨噬細(xì)胞：在無菌條件下，用 D-Hank’s液灌洗樣品腹腔，并收集灌洗液，然后進(jìn)行低溫離心（4℃），取其沉淀物（含巨噬細(xì)胞），用于巨噬細(xì)胞吞噬活性測定實(shí)驗(yàn)[8]。

1.2.3 測定方法

（1）T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測定。 采用微量全血培養(yǎng)氚標(biāo)胸腺嘧啶3H-TdR摻入法[9]測定T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，用刺激指數(shù)(stimulationindex,SI=實(shí)驗(yàn)組cpm均值/對照組cpm均值)表示。該法客觀、準(zhǔn)確，且復(fù)現(xiàn)好。

1）無菌條件下取抗凝血，加入96孔板孔中，每孔0.1mL。每樣6孔，其中3孔為刺激孔，每孔加100μLConA（終濃度為 5μg/L），另 3孔為未刺激孔，每孔加 100μL RPMI-1640。

2）將載樣的孔板置于5%CO2培養(yǎng)箱（保持恒溫 37℃）孵育 6h，每孔加3H–TdR20μL，繼續(xù)培養(yǎng)16h。

3)分別收集每孔培養(yǎng)物,置于直徑24 mm圓玻璃纖維紙上，抽氣過濾，并用重蒸水充分洗滌。

4)用80℃烘干載樣纖維紙，約1h后，分別浸于脂溶性閃爍液中。

5)于β-液體閃爍計(jì)數(shù)器上測cpm值，并計(jì)算刺激指數(shù)（SI）。

（2）紅細(xì)胞免疫的測定。用紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率(red blood cell C3breceptor ratio，RC3bRR)作為指標(biāo)來檢測紅細(xì)胞的免疫功能。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[10]的方法，測定紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率（RC3bRR）。

1)取血1 mL，抗凝，生理鹽水洗3次，1500 rpm離心10 min。

2)細(xì)胞計(jì)數(shù)，加少許生理鹽水調(diào)至1.25×107/mL。

3)酵母同樣處理，調(diào)成1.0×108/mL，過濾后恢復(fù)原體積煮沸20min，充分混勻，洗2次。

4)取 50 μL血漿加 50 μL酵母 37℃水浴 15 min，再加 50 μL 紅細(xì)胞混勻，37℃水浴 30 min。

5)上述液體加 25 μL，0.25%戊二醛混勻，涂片，吹干。

6)瑞氏染色，鏡檢。

（3）巨噬細(xì)胞吞噬活性的測定。參照文獻(xiàn)[8]改進(jìn)的噻吩蘭 （MTT）法測定巨噬細(xì)胞吞噬活性，用OD570值表示，其值高低與吞噬活性成正比。

1)于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用頸椎脫臼處死大鼠，注射5～10 mL D-Hank’s液，收集腹部細(xì)胞懸液。

2)將細(xì)胞懸液置于離心機(jī)上，用1500 rpm離心8 min，用1640液洗滌沉淀物。

3)再換完全1640液，并細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)至2×106/mL。

以下培養(yǎng)、加MTT和DMSO，以及測定OD570值方法同參考文獻(xiàn)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝酸鑭對大鼠機(jī)體淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的的影響

2.1.1 短期影響 飼喂硝酸鑭10d，大鼠外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果見表1。表1表明，短期實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的SI值均高于對照組，其中實(shí)驗(yàn)組II最高（1.11±0.35）,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＞0.05，實(shí)驗(yàn)組與對照組差異未達(dá)到顯著水平。

表1 飼喂硝酸鑭對大鼠外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用的影響（短期）

2.1.2 長期影響 飼喂硝酸鑭30d，大鼠外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果見表2。表2表明，長期實(shí)驗(yàn)中，3實(shí)驗(yàn)組的SI值不僅高于對照組，而且各實(shí)驗(yàn)組與對照組的差值明顯高于短期實(shí)驗(yàn)。長期實(shí)驗(yàn)中，仍是實(shí)驗(yàn)組II的SI值最高，達(dá)1.46±0.19*。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05，實(shí)驗(yàn)組II與對照組差異達(dá)到顯著水平。說明一定劑量的硝酸鑭能提高大鼠外周淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。

表2 飼喂硝酸鑭對大鼠外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用的影響（長期）

2.2 硝酸鑭對大鼠機(jī)體紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率(RC3bRR)的影響

硝酸鑭對大鼠機(jī)體紅細(xì)胞免疫功能的影響見表3和表4，結(jié)果表明，在短期和長期實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的大鼠紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率 （RC3bRR）均高于對照組。短期實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組I最高，為4.74±

1.63 ，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＞0.05，與對照組差異未達(dá)到顯著水平。長期實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的大鼠紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率（RC3bRR）同樣高于對照組，其中實(shí)驗(yàn)組I和實(shí)驗(yàn)組II均較高，分別為4.74±1.63和4.28±2.43，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05，差異達(dá)到顯著水平。說明硝酸鑭能促進(jìn)大鼠紅細(xì)胞免疫，且劑量不同，效果不同。

表3 飼喂硝酸鑭對大鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響（短期）

表4 飼喂硝酸鑭對大鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響（長期）

2.3 硝酸鑭對大鼠機(jī)體巨噬細(xì)胞活性的的影響

飼喂大鼠硝酸鑭溶液，其腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的變化如表5和表6。表5表明，短期實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組I、II的OD570均高于對照組，實(shí)驗(yàn)組II高于實(shí)驗(yàn)組 I，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組 II（OD570＝1.86±0.21）與對照組差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組III低于對照組。表6表明，長期實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果與短期實(shí)驗(yàn)的相似，實(shí)驗(yàn)組II與對照組有明顯差異，且達(dá)顯著（水平＜0.05）。這說明一定劑量的硝酸鑭能促進(jìn)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬作用，而且這種作用與大鼠攝入的硝酸鑭劑量有關(guān)。

表5 飼喂硝酸鑭對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（短期）

表5 飼喂硝酸鑭對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（長期）

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了硝酸鑭對機(jī)體淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、紅細(xì)胞RC3bRR和巨噬細(xì)胞活性的影響，得出以下結(jié)論：(1)硝酸鑭對大鼠機(jī)體的免疫功能存在明顯影響，且與劑量存在依賴效應(yīng)；(2)低劑量的硝酸鑭明顯地提高淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率、紅細(xì)胞RC3bRR和巨噬細(xì)胞活性。(3)高劑量的硝酸鑭對大鼠的免疫功能可能存在抑制作用。因此，筆者認(rèn)為在畜禽飼料中添加適量的稀土（RE），不僅可以提高畜禽的生長性能，而且還能增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，減少疾病的發(fā)生，降低死亡率，從而獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益。但劉志宏等報(bào)道，給妊娠期小鼠飼喂混合稀土(RE(NO3)3)，稀土可以通過胎盤屏障進(jìn)入胚胎，影響胚胎和仔鼠的發(fā)育，因此，用于繁殖的動(dòng)物不宜使用稀土飼料添加劑。

[1]宋智娟，趙國先，張曉云，等.稀土的作用機(jī)理及飼用安全性[J].中國飼料，2005(10):24-25.

[2]常文環(huán)，李德發(fā)，朱曉萍，等.稀土對肉雞生長性能的影響[J].飼料研究，1994(12):4.

[3]何若鋼，夏中生.飼糧中添加稀土對生長肥育豬生長性能的影響[J].江西畜牧獸醫(yī)雜志，2000(4)：6-8.

[4]王敏奇，許梓芳.飼糧中添加鑭對豬生長的影響及安全性[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003,23(1)：88-89.

[5]吳建明，任建民，楊儀正，等.稀土飼料添加劑飼養(yǎng)綿羊的劑量選擇試驗(yàn)[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志，2001,31(1)：20-21.

[6]涂序珉，呂慧敏，張翠蘭，等.稀土對受照射小鼠免疫功能的影響[J].中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)，2005,25(3)：230-231.

[7]王宗惠，龐新民，蘇英，等.稀土對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞特異吞噬功能的作用影響[J].衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，1994，8（3）：220－221.

[8]陳哲生，孫明杰，劉振龍，等.噻唑藍(lán)比色法檢測環(huán)孢霉素A和氫化考地松對小鼠淋巴細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞的作用 [J].藥學(xué)情報(bào)通訊，1994，12(1)：49-51.

[9]葉維新.實(shí)驗(yàn)核醫(yī)學(xué)技術(shù)[M].長春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，1991:58.

[10]郭峰，錢寶華，張樂之.現(xiàn)代紅細(xì)胞免疫學(xué)[M].上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2002：61-62.

[11]劉志宏，雷志明，魏子濤，等.混合稀土硝酸鹽對仔鼠免疫功能的影響[J].中國公共衛(wèi)生，2003,19(2):136－138.

S 811

A

1674-1102(2011)06-0044-03

2011-08-16

安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（kj2007A130ZC）。

劉小陽(1963-)，男，安徽懷寧人，宿州學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系教授，安徽理工大學(xué)碩士生導(dǎo)師，主要從事細(xì)胞學(xué)和生理學(xué)方面的教學(xué)與研究工作。

[責(zé)任編輯：錢立武]