大蒜辣素對輻射引起的免疫損傷防護(hù)作用的研究

王 鑫，吳 瑕，朱曉鑫

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)成棟學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

大蒜辣素對輻射引起的免疫損傷防護(hù)作用的研究

王 鑫1，2，吳 瑕2，朱曉鑫3

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)成棟學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

構(gòu)建!射線輻射模型，考察了輻射對小鼠免疫系統(tǒng)損傷研究的最佳劑量，并研究了大蒜辣素對!射線輻射引起的小鼠免疫系統(tǒng)損傷的防護(hù)效果。結(jié)果表明：!射線對小鼠進(jìn)行照射的最佳劑量為5Gy。照射前補(bǔ)充大蒜辣素后，以小鼠碳廓清指數(shù)、血清溶血素含量、脾指數(shù)、DTH足跖增厚程度為免疫系統(tǒng)指標(biāo)，16mg/kg·d的劑量組可以有效地防護(hù)由于!射線輻射造成的免疫系統(tǒng)損傷。

大蒜辣素，輻射，免疫系統(tǒng)

大蒜辣素純化物 實(shí)驗(yàn)室制備，純度73%；!射線輻射儀 黑龍江省農(nóng)科院提供；昆明種小白鼠雄性，體重18～22g，哈爾濱腫瘤醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 輻射對免疫系統(tǒng)損傷模型構(gòu)建的方法 正常小鼠120只，空白、1、3、5Gy輻射劑量的小鼠各30只，輻射劑量及劑量率設(shè)計(jì)如表1。輻射后的小鼠，分別進(jìn)行三部分實(shí)驗(yàn)，其中碳廓清實(shí)驗(yàn)、脾指數(shù)測定為第一部分，血清溶血素測定、DTH足跖增厚法指標(biāo)的測定為第二部分，小白鼠存活率為第三部分，為防止每一部分實(shí)驗(yàn)之間互相影響，所以每一部分均采用不同批次小白鼠。且分別從免疫分子、免疫細(xì)胞、免疫器官三方面對各種輻射劑量引起的免疫系統(tǒng)損傷進(jìn)行綜合考慮。根據(jù)以上測定指標(biāo)確定輻射引起的免疫系統(tǒng)損傷的最佳輻射劑量。

表2 不同輻射劑量對免疫系統(tǒng)損傷各指標(biāo)的影響（sd.）

表2 不同輻射劑量對免疫系統(tǒng)損傷各指標(biāo)的影響（sd.）

注：a與同行NC組相比，P＜0.05；b與同行NC組相比，P＜0.01；空白組與各輻射劑量組小鼠數(shù)量均為10只。

免疫損傷指標(biāo)輻射劑量（Gy）空白組（NC）135校正廓清指數(shù) 5.45±0.98 4.88±0.90a 4.18±1.04b 3.89±1.07b血清溶血素（HC50） 48.68±15.23 10.46±3.34b 2.09±0.89b 1.92±0.83b脾指數(shù)（mg/g） 3.58±0.31 2.46±0.33b 1.66±0.15b 1.48±0.17b足跖腫脹度（mm） 0.55±0.19 0.61±0.17 0.56±0.19 0.19±0.11b小鼠存活有效天數(shù)（d）30 30 30 27.4

表1 輻射劑量及劑量率設(shè)計(jì)表

1.2.2 大蒜辣素對輻射引起的免疫損傷防護(hù)模型構(gòu)建的方法 正常小鼠100只，空白、輻射空白、高、中、低劑量大蒜辣素給藥組的小鼠各20只，輻射劑量為5Gy。輻射前，對高、中、低劑量給藥組分別灌胃16、8、4mg/kg·d的大蒜辣素，灌胃時(shí)間為2周，空白和輻射空白則灌胃生理鹽水。輻射后的小鼠，分別進(jìn)行兩部分實(shí)驗(yàn)，其中碳廓清實(shí)驗(yàn)、脾指數(shù)測定為第一部分，血清溶血素測定、DTH足跖增厚法指標(biāo)的測定為第二部分。研究大蒜辣素對輻射引起的免疫系統(tǒng)損傷的防護(hù)作用。

1.2.3 碳廓清指數(shù)的測定方法 于輻射后第3d，小鼠尾靜脈注射生理鹽水稀釋3倍的印度墨汁，按每10g體重0.1mL計(jì)算。待墨汁注入立即計(jì)時(shí)，注入墨汁后2、10min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20!L，并將其加到2mL Na2CO3溶液中。用721分光光度計(jì)在600nm波長處測光密度值（OD），以0.1%Na2CO3溶液作空白對照。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，計(jì)算公式如下：

式中：a-校正的吞噬指數(shù)；K-未經(jīng)校正的吞噬指數(shù)；OD2-脈注入碳粒T2時(shí)的吸光度值；OD1-靜脈注入碳粒T1時(shí)的吸光度值。

采用SPSS 13軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。

1.2.4 血清溶血素含量的測定方法 照射當(dāng)天，小鼠腹腔注射稀釋的SRBC 0.2mL（約1×108個SRBC）進(jìn)行免疫，4d后小鼠眼眶取血，分離出血清并用生理鹽水稀釋500倍。取1mL稀釋血清加入試管中，然后加入0.5mL 10%SRBC（約1×109個SRBC）懸浮液置于冰浴中，再加入1mL豚鼠血清，隨即移置于37℃水浴中保溫10min，保溫結(jié)束后，放入冰浴中終止反應(yīng)，2000r/min離心10min，取上清液1mL與3mL都氏試劑混合，靜置10min。在540nm處比色，以不加血清的空白管做對照，測定吸光值，按下式計(jì)算半數(shù)溶血值（HC50）：

SRBC半數(shù)溶血時(shí)的吸光度測定方法：取0.25mL SRBC（約1×109個SRBC）用都氏試劑稀釋至4mL搖勻后靜止10min，離心取上清液在540nm處比色。

采用SPSS 13軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，以HC50表示小鼠血清溶血能力。

1.2.5 脾指數(shù)測定方法 于輻射后第3d，稱量小鼠體重，將小鼠處死，取脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，公式如下：

采用SPSS 13軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。

1.2.6 遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)程度的測定方法 小鼠用2%（v/v）SRBC腹腔或靜脈免疫，每只鼠注射0.2mL（約1×108個SRBC）。免疫4d后，測量左后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射2%（v/v）SRBC，每只鼠20!L（約1×108個SRBC），注射后于24、48h分別測量左后足跖部厚度，同一部位測量三次，取平均值。

采用SPSS 13軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。以前后足跖厚度的差值來表示DTH的程度。

1.2.7 小白鼠存活率的測定方法 觀察小鼠30d的存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 引起免疫系統(tǒng)損傷的輻射劑量的選擇

2.1.1 不同輻射劑量對碳廓清指數(shù)的影響 如表2所示，小鼠受到不同劑量組射線照射后，隨著輻射劑量的增加，反映巨噬細(xì)胞吞噬功能的校正碳廓清指數(shù)明顯降低，說明"射線對小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬功能造成了傷害，其中3、5Gy劑量組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著。

2.1.2 不同輻射劑量對血清溶血素的影響 如表2所示，小鼠受到照射后，B淋巴細(xì)胞活化產(chǎn)生具有抗體能力的血清溶血素生成明顯低于正常對照組，且隨著輻射劑量的增加，溶血素的生成量逐漸下降，說明"射線對小鼠的血清溶血素生成能力造成了傷害，其中1、3、5Gy劑量組差異統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著。

2.1.3 不同輻射劑量對脾指數(shù)的影響 脾指數(shù)作為臟器指數(shù)之一，可在一定程度上反映免疫系統(tǒng)受損情況。如表2所示，小鼠受照射后，由于脾臟細(xì)胞大量死亡，脾臟重量明顯減輕，脾指數(shù)降低，且隨著輻射劑量的增加，脾指數(shù)也明顯隨之降低，各照射組小鼠脾指數(shù)與正常對照組相比，1、3、5Gy劑量組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著。

表3 大蒜辣素對輻射小鼠碳廓清指數(shù)的影響（sd.）

表3 大蒜辣素對輻射小鼠碳廓清指數(shù)的影響（sd.）

注：a與同行NC組相比，P＜0.05；b與同行RC組相比，P＜0.05；c與同行RC組相比，P＜0.01；NC和RC組與大蒜辣素各不同劑量給藥組所用小鼠數(shù)量均為10只。

免疫損傷指標(biāo) 空白組（NC） 輻射空白組（RC） 4mg/kg·d 8mg/kg·d 16mg/kg·d校正廓清指數(shù) 5.62±1.09 4.09±1.16a 4.11±1.01 4.37±1.61 4.82±0.93b血清溶血素（HC50） 48.68±15.23 1.89±0.73a 1.94±0.81 3.01±1.61c 3.22±1.52c脾指數(shù)（mg/g） 3.43±0.38 1.66±0.15a 1.63±0.22 1.71±0.18 2.38±0.37b足跖厚度差值（mm） 0.55±0.20 0.19±0.11a 0.17±0.12 0.40±0.13 0.62±0.21b

2.1.4 不同輻射劑量對遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)程度的影響

SRBC可刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞，當(dāng)再以SRBC攻擊時(shí)，即可見攻擊部位出現(xiàn)遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)。小鼠受到照射后，由于SRBC可刺激的T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞的能力減弱，足跖腫脹度明顯降低。

如表2所示，1、3Gy劑量組的足跖腫脹度差異不顯著，而5Gy劑量組輻照后，差異極顯著。

2.1.5 不同輻射劑量對小白鼠存活率的影響 如表2所示，小鼠受照射后，1、3Gy劑量組30d內(nèi)小鼠無死亡，而5Gy劑量組有個別小鼠死亡，由此可看出，1、3、5Gy劑量組，都不會對小鼠產(chǎn)生半數(shù)致死效應(yīng)。其對免疫系統(tǒng)所造成的損傷都具有可恢復(fù)性。

綜上所述，以1、3、5Gy輻射劑量的!射線分別照射小白鼠。輻照后的小白鼠與對照組相比，碳廓清指數(shù)、血清溶血素含量及脾指數(shù)均有明顯差異，且統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。而DTH足跖增厚程度，只有5Gy輻射劑量組差異顯著。將以上指標(biāo)綜合考慮，確定5Gy !射線為輻射對免疫系統(tǒng)的損傷研究的最佳劑量。

2.2 大蒜辣素對輻射引起的免疫系統(tǒng)損傷的防護(hù)作用

2.2.1 大蒜辣素對輻射小鼠碳廓清指數(shù)的影響 如表3所示，小鼠受到5Gy!射線照射后，反映巨噬細(xì)胞吞噬功能的校正廓清指數(shù)值明顯降低，照射前補(bǔ)充大蒜辣素組的校正廓清指數(shù)均比照射組有所增加，且隨著大蒜辣素濃度的增加，校正廓清指數(shù)逐漸增加，其中16mg/kg·d劑量組與照射組相比，差異顯著。

2.2.2 大蒜辣素對輻射小鼠血清溶血素含量的影響小鼠受到照射后，B細(xì)胞活化產(chǎn)生抗體能力的血清溶血素生成明顯低于正常對照組，溶血素的生成量僅為正常組的4%左右，補(bǔ)充大蒜辣素純化物后血清溶血素的生成量比照射對照組有所升高，且隨著大蒜辣素濃度的增加，血清溶血素的含量有所增加，其中8、16mg/kg·d血清溶血素升高明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

2.2.3 大蒜辣素對輻射小鼠脾指數(shù)的影響 小鼠受到5Gy劑量組輻照射后，小鼠脾指數(shù)的影響明顯降低，補(bǔ)充大蒜辣素純化物后，小鼠脾指數(shù)比照射對照組有所升高，其中16mg/kg·d小鼠脾指數(shù)升高明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

2.2.4 大蒜辣素對輻射小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)程度的影響 小鼠受5Gy劑量組輻照后，由于SRBC可刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞的能力減弱，足跖腫脹度明顯降低，補(bǔ)充大蒜辣素純化物后，足跖腫脹度比照射對照組有所升高，其中16mg/kg·d升高明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

3 結(jié)論與討論

3.1 5Gy為!射線輻射對小鼠免疫系統(tǒng)損傷研究的最佳劑量。

3.2 小鼠受到5Gy劑量!射線輻射后，與空白對照組相比，小鼠碳廓清指數(shù)、血清溶血素含量、脾指數(shù)、DTH足跖增厚程度都有明顯降低，補(bǔ)充大蒜辣素純化物后，與輻射對照組相比，各項(xiàng)指標(biāo)都有所升高，其中16mg/kg·d劑量組升高明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由此可見，16mg/kg·d劑量的大蒜辣素純化物可起到對輻射引起的免疫系統(tǒng)損傷的防護(hù)作用，但其對血液系統(tǒng)及其骨髓造血系統(tǒng)的抗輻射作用還需進(jìn)一步的研究，另外其抗輻射作用的機(jī)理也需進(jìn)一步的驗(yàn)證。由于大蒜辣素的刺激性，高劑量（25mg/kg·d）可以引起小鼠豎毛和厭食等現(xiàn)象的發(fā)生，應(yīng)限制其高劑量的應(yīng)用。但是相信隨著微膠囊等掩蔽技術(shù)的日益成熟，大蒜辣素在人類抗輻射保健食品中的作用會越來越大。

［1］Herman-Antosiewicz A，Singh SV.Signal transduction pathways leading to cell cycle arrest and apoptosis induction in cancer cells by Allium vegetable-derived organosulfur compounds［J］.MutatRes，2004，555（1-2）：121-131.

［2］Wu X，Kassie F，Mersch-Sundermann V.Induction of apoptosis in tumor cellsby naturally occurring sulfur-containing compounds［J］.MutatRes，2005，589（2）：81-100.

［3］Talia Miron.Allicin inhibits cell growth and induces apoptosis through the Mitochondrial pathway in HL60 and U937 cells［J］. Journal of Nutritional Bioche-mistry，2008，19：524-535.

［4］燕丹.大蒜辣素致肝癌細(xì)胞HepG2凋亡研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19（12）：3055-3057.

［5］梁衛(wèi)江.大蒜油對胃癌細(xì)胞 cyclin E表達(dá)的抑制作用［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27（8）：1241-1243.

［6］Ya-Ping Yang.Allicin induces apoptosis，cell cycle arrest and microtubule disassembly in human nasopharyngeal carcinoma KB cells［J］.Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2009，18：114-120.

［7］MaoMao An.Allicin enhances the oxidative damage effect of amphotericin B against Candida albicans［J］.International Journal of Antimicrobial Agents，2009，33：258-263.

［8］Seong-Jun Cho.Allicin，a major component of garlic，inhibits apoptosis of macrophage in a depleted nutritional state［J］. Nutrition，2006，22：1177-1184.

［9］Alon Lang.Allicin inhibits spontaneous and TNF-a induced secretion of proinflammatory cytokines and chemokines from intestinal epithelial cells［J］.Clinical Nutrition，2004，23：1199 -1208.

［10］Yoav Manaster.Allicin and disulfiram enhance platelet integrin αIIbβ3-fibrinogen binding［J］.Thrombosis Research，2009，124：477-482.

Study on protective effects of allicin on immune injury caused by radiation

WANG Xin1，2，WU Xia2，ZHU Xiao-xin3
（1.College of Chemical Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China；2.College of Cheng Dong，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；3.College of Resources&Environmental，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

!-ray radiation model was constructed，radiation damage of the immune system of mice on the optimum dose and the allicin of radiation-induced immune injury of the protective effect were studied.The results showed that the best dose of!-ray irradiation of mice was 5Gy.Added allicin before irradiation，carbon clearance index，

serum hemolysin concentration，spleen index，DTH plantar thickening of the degree as the immune system of indicators，and 16mg/kg·d dose groups can be an effective protective for immune system due to radiation damage.

allicin；radiation；immune system

TS201.4

A

1002-0306（2011）02-0313-04

大蒜辣素是大蒜中的主要生物活性物質(zhì)，化學(xué)名稱為二烯丙基硫代亞磺酸酯。國內(nèi)外對大蒜辣素功能的研究主要集中在抗腫瘤［1-2］、抗癌、抑菌方面，研究表明，大蒜辣素可以抑制白血病細(xì)胞系HL60和U937的生長并誘導(dǎo)其凋亡［3］，對肝癌細(xì)胞HepG2［4］、胃癌細(xì)胞cyclin E［5］和人鼻咽癌KB細(xì)胞［6］均具有促凋亡的作用。大蒜辣素還具有廣泛的抗菌作用，例如抑制白色念珠菌［7］，并在保護(hù)人體巨噬細(xì)胞［8］、抑制炎癥細(xì)胞［9］和促進(jìn)藥物［10］在人體內(nèi)的發(fā)揮等方面有著很好的效果。人類生存環(huán)境中面臨的各種輻射種類日益增多，輻射劑量日益增大，大蒜辣素在抗輻射方面的功能，國內(nèi)外報(bào)道得還很少，本文首先探討了!射線輻射小鼠的最佳輻射研究劑量，并進(jìn)一步研究了大蒜辣素對于!射線輻射引起的小鼠免疫系統(tǒng)損傷的防護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2010-01-27

王鑫（1984-），男，助教，研究方向：生物活性物質(zhì)的功能性。