青藏高原藏木香總黃酮提取工藝研究及含量測定

楊月琴，彭 敏，胡鳳祖，常小平，馬海樂，馬世震，*

（1.中國科學院西北高原生物研究所，青海西寧810008；2.中國科學院研究生院，北京100049；3.河南科技大學，河南洛陽471003；4.青海省大通寶庫林場，青海大通810100）

青藏高原藏木香總黃酮提取工藝研究及含量測定

楊月琴1，2，3，彭 敏1，胡鳳祖1，常小平4，馬海樂3，馬世震1，*

（1.中國科學院西北高原生物研究所，青海西寧810008；2.中國科學院研究生院，北京100049；3.河南科技大學，河南洛陽471003；4.青海省大通寶庫林場，青海大通810100）

目的：研究藏木香中總黃酮的提取工藝及含量測定。方法：采用正交實驗進行優選，考察乙醇濃度、溶劑倍數、提取時間等因素對黃酮得率的影響，用紫外分光光度法測定其含量。結果：乙醇濃度是主要的影響因素，最佳提取工藝為選用75%乙醇作為提取溶劑，料液比1∶20，水浴熱回流提取2h。以蘆丁為對照品，采用分光光度法測定出總黃酮平均含量為0.28mg/g。結論：提取工藝可行；紫外分光光度法簡單、快速、準確；為藏木香深度開發提供了科學依據。

藏木香，黃酮，提取工藝，紫外分光光度法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藏木香 青海省大通寶庫林場藥材人工種植實驗基地栽培，取其根，洗凈，自然陰干，粉碎，備用；蘆丁對照品 中國藥品生物制品檢定所；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇 分析純；超純水。

Cary 300紫外掃描分光光度儀 美國 Varin；KQ-100E型超聲波清洗器 昆山科技有限公司；MOLEMENT元素型超純水機 上海摩勒生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 正交實驗設計提取工藝 根據單因素考察結果、聯系生產實際及參考文獻資料，認為總黃酮成分的提取與乙醇濃度（因素A）、溶劑倍數（因素B）及提取時間（因素C）3個因素有關，故選擇其作為考察因素，用L9（34）正交表進行實驗設計、優選，見表1。

表1 總黃酮提取條件因素水平表

1.2.2 含量測定方法 采用分光光度法。黃酮類化合物是具有苯并吡喃環結構的一類天然化合物的總稱，一般具有4位羰基，且呈現黃色。黃酮類化合物多分布于植物中，大多數以苷的形式存在。黃酮類化合物中的3-羥基、4-羥基或5-羥基、4-羰基或鄰位酚羥基在亞硝酸鹽存在的堿性條件下與Al（NO3）3形成穩定的紅色絡合物。此絡合物可不經分離用分光光度法直接測定樣品液中總黃酮的含量。該法中總黃酮的含量的最低檢測限為3.5!g/mL。

1.2.2.1 對照品溶液和樣品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品5.0mg，60%乙醇溶解，轉入50mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.10mg/mL的對照品溶液。

稱取干燥的栽培藏木香粉末1.500g，置平底燒瓶中，按照表1正交實驗設計方法加入一定濃度、一定體積的乙醇，在80℃恒溫水浴中回流提取2次，過濾，合并提取液，濾液減壓回收乙醇至無乙醇味，再用60%乙醇定容至50mL，搖勻，即為樣品液，備用。

1.2.2.2 分光光度法 精密吸取一定量對照品和樣品溶液置于50mL容量瓶中，取2.0mL加60%乙醇至6.0mL，加5%NaNO2溶液1.0mL，搖勻，放置6min，加10%Al（NO3）3溶液1.0mL，搖勻，放置6min，加10% NaOH溶液10mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min，以相應試劑作空白，測定吸光度。顯色后的對照品和樣品溶液在400～600nm間掃描，對照品和樣品溶液均在510nm處有最大吸收。

2 結果與分析

2.1 含量測定方法研究結果

2.1.1 標準曲線 精密量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置于50mL容量瓶中，各取2.0mL以上述

1.2.2.2 方法測定吸光度（見圖1）。

圖1 蘆丁標準曲線圖

以質量濃度（X）與吸光度（Y）進行線性回歸，得回歸方程為Y=9.53X+0.0462，r=0.9993，結果表明在此范圍內線性關系良好。

2.1.2 精密度實驗 取同一濃度的對照品溶液5份，各2.0mL依1.2.2.2測定方法測定吸光度（見表2）。

表2 精密度實驗結果（n=5）

計算RSD為1.10%（n=5）。結果表明，在該條件下精密度良好。

2.1.3 重復性實驗 對5份平行制備的藏木香樣品溶液，各取2.0mL依1.2.2.2測定方法測定吸光度，計算總黃酮的平均含量為0.2536mg/g，RSD為1.64%。表3表明，該條件下重現性良好。

表3 樣品重復性實驗（n=5）

2.1.4 回收率實驗 稱取同一批藏木香粉末，分別精密加入0.20mg蘆丁對照品，按樣品溶液制備法制備，并測定含量，計算回收率，結果見表4。

表4 回收率實驗結果（n=5）

計算總黃酮回收率的平均值為99.0%，RSD為1.54%（n=5）。測定結果表明，用此方法進行青藏高原藏木香總黃酮的測定，回收率符合要求。

2.2 正交實驗提取工藝結果

結果見表5及表6。

表5的結果表明，用正交實驗進行優選，得到藏木香總黃酮提取的較優水平搭配為A2B3C3；因素主次順序A＞B＞C。即藏木香總黃酮較優提取工藝為：選用75%乙醇作為提取溶劑，料液比1∶20，水浴熱回流提取2h。表6方差分析結果表明，乙醇濃度對總黃酮含量的影響顯著，F值=26.57143＞F0.05；而溶劑倍數和提取時間均對其無顯著影響。如從節約資源及時間方面考慮，建議在生產實踐中，將較優水平搭配A2B3C3中的B3改為B2，C3改為C1，即用75%乙醇做提取液，料液比1∶15，回流提取1h，重復2次來作為藏木香總黃酮類化合物提取的較優提取工藝。

表5 藏木香總黃酮正交實驗結果（n=5）

表6 方差分析結果

2.3 驗證實驗

按最佳提取工藝A2B3C3進行驗證實驗，重復5次，結果總黃酮含量分別為 0.273、0.282、0.285、0.279、0.281mg/g，平均為0.28mg/g，RSD為1.60%。

3 結論

3.1 采用分光光度法檢測藏木香黃酮類化合物，儀器操作簡單方便，蘆丁標準溶液濃度Y在2～10μg/mL范圍內與吸光度X呈良好的線性關系（Y=9.53X+ 0.0462，r=0.9993）；精密度良好，RSD為 1.10%（n=5）；重現性良好，RSD為1.64%（n=5）；平均回收率為99.0%。

3.2 用正交實驗進行優選，得到藏木香總黃酮最佳提取工藝為：選用75%乙醇作為提取溶劑，料液比1∶20，水浴熱回流提取2h。乙醇濃度對總黃酮含量的影響顯著，F值＞F0.05；而溶劑倍數和提取時間均對其無顯著影響，F值＜F0.05。經驗證實驗得到藏木香總黃酮的平均含量為0.28mg/g。在本研究的基礎上，繼續開展對藏木香黃酮類物質的作用機制、療效等研究，為藏木香功能食品及其他產品研發提供科學依據。

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Study on the extraction technique and quantification of total flavonoids in Inula racemosa grown in Qinghai-Tibet plateau

YANG Yue-qin1，2，3，PENG Min1，HU Feng-zu1，CHANG Xiao-ping4，MA Hai-le3，MA Shi-zhen1，*
（1.Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810008，China；2.Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China；3.Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China；4.Qinghai Baoku Forestry Farm，Datong 810100，China）

Objective：Aim to study the best conditions of extraction techniques for total flavonoids in Inula racemosa. Methods：The best conditions of extraction technique for total flavonoids were optimized with orthogonal experiment.Developed by ethanol solution with different concentrations，solvent multiples and extraction duration，determination of total flavonoids with UV-spectrophotometry was made.Results：Ethanol concentration was the major factor for determining total flavonoids contents.The best conditions for the extraction techniques of total flavonoids were：75%ethanol which was 20 times of the medicine amount，reflux extracting 2 hours.The yield of total flavonoids in Inula racemosa was estimated at 0.28mg/g.Conclusion：The extraction techniques are feasible and the UV-spectrophotometric method is simple，quick and accurate.

Inula racemosa；flavonoids；extraction technique；UV-spectrophotometric method

TS201.2

B

1002-0306（2011）02-0251-03

藏木香（Inula racemosa Hook.f.）為菊科植物，主要分布在青海、甘肅、西藏、四川等省區海拔2000m以上地區，氣味芳香濃郁，具有行氣鎮痛、健脾消食、溫中和胃等功效；藏木香既含有藥用成分，又是保健食品敷料和香料的主要成分［1-4］，是一種急需開發利用的資源，其潛在的功能食品開發前景值得我們發掘和研究。目前僅青海、甘肅和四川省相關科研與企業開展了藏木香的人工栽培和繁育技術研究與攻關，其營養價值、藥用價值及抗病機理及產品研發等卻尚未得到深入的研究［4-5］。黃酮類化合物是中草藥的活性成分之一，具有多種醫療、保健功效，可清除體內自由基，延緩衰老和抑制腫瘤，防護紫外線傷害等，除了具有顯著的藥用價值外，還可作為食品添加劑直接應用在食品中或者作為活性成分開發成為功能性食品。而定性定量檢測是對其進行分類和質量評價的前提條件，盡管其他一些現代化的儀器分析方法如毛細管電泳和微膠束毛細管色譜也已經被應用于黃酮類物質的檢測，但目前應用最廣泛的還是分光光度法及使用C18柱的HPLC系統［6-12］。青藏高原藏木香的黃酮類化合物尚未被開發利用，本研究首次對藏木香根中的總黃酮進行提取工藝研究及含量測定，旨在為藏木香保健品的進一步研究與開發提供基礎的科學的理論依據。

2010-05-20 *通訊聯系人

楊月琴（1975-），女，碩士，講師，從事功能性食品開發方面的研究。

河南科技大學特聘教授科研啟動費（09004004）；青海省重點攻關項目（2006-034）。