草魚肉蛋白酶解物功能特性及質量控制的研究

李 雪，尤 娟，羅永康

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

草魚肉蛋白酶解物功能特性及質量控制的研究

李 雪，尤 娟，羅永康*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

采用Neutrase對草魚魚肉蛋白進行了酶解，得到了水解度（DH）為4.72%、9.80%、13.32%的酶解產物（NH），并分析了pH與水解度對酶解產物功能特性的影響。結果表明，酶解產物的溶解性、乳化性、起泡性在pH為4時達到最低，而后隨pH的增大而增加。在pH為3～8的范圍內隨水解度的增加，酶解產物的溶解性增加，起泡性降低。pH為4時，水解度為4.72%、9.80%、13.32%的酶解產物的熱穩定性之間存在顯著性差異（P＜0.05），且隨水解度升高而增大。在pH為3～5的范圍內酶解產物的乳化性隨水解度升高而降低。酶解產物的溶解性、乳化性、起泡性間存在相關性（P＜0.05）。

草魚，水解，功能特性

1 材料與方法

1.1 材料與設備

草魚 購于北京健翔橋農貿市場，活體運至實驗室，去鱗、去內臟、去頭、去骨、洗凈后進行采肉（取白肉），用攪碎機攪成肉糜；三硝基苯磺酸（TNBS） 美國Sigma公司；Neutrase 丹麥NOVO公司；魯花牌5S壓榨花生油 市售；其他所用試劑 均為化學分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 草魚魚肉蛋白水解產物的制備工藝 草魚肉糜→與水混合→滅內源性酶（90℃、15min）→均質→調溫度、pH→加中性蛋白酶酶解→滅酶（90℃、10min）→離心（3600r/min、20min）→取上清液→冷凍干燥→草魚魚肉蛋白水解產物

1.2.2 水解產物成分的測定 蛋白質含量的測定：凱氏定氮法［7］；脂肪含量的測定：索氏抽提法（GB5497-85）；水分含量的測定：105℃恒重法（GB5512-85）；灰分含量的測定：550℃灼燒法（GB5505-85）。

1.2.3 水解度的測定 采用三硝基苯磺酸法（Trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）［8-9］：將樣品用1%十二烷基硫酸鈉（SDS）稀釋至一定濃度（1L樣品中含有的氨基當量為0.25×10-3～2.5×10-3）。取0.25mL的樣品混合2.00mL pH8.2磷酸緩沖溶液和2.00mL 0.1%TNBS溶液，于50℃暗室中反應60min。反應完畢之后，立即用4.00mL 0.1mol/L HCl終止反應，接著在室溫下放置30min，于420nm下測其吸光值，在0～2.5×10-3mol/L L-亮氨酸的范圍內作標準曲線。水解度的計算公式如下：

式中，AN1：未水解樣品中每克蛋白含有的氨基當量（mmol/g蛋白）；F1：未水解樣品的稀釋倍數；AN2：水解樣品中每克蛋白含有的氨基當量（mmol/g蛋白）；F2：水解樣品的稀釋倍數；htot：每克原料蛋白質的總的肽鍵毫摩爾數，本研究采用魚肉為原料取htot=8.6。

1.2.4 功能特性的測定

隴西縣是甘肅省43個國家級貧困縣之一，全省58個扶貧重點縣之一，整體屬于六盤山等14個連片扶貧開發區域，2017年全省減少貧困人口67萬人，貧困發生率由14.2%下降到9.6%，2017年隴西縣貧困發生率依然是12.4%（回退前），貧困面還很大。如何繼續深入實施東西部扶貧協作，精準扶貧、精準脫貧，實現到2020年現行標準下農村貧困人口實現脫貧，解決區域性整體貧困意義重大。

1.2.4.1 溶解性的測定 稱取0.01g水解產物，用去離子水配制成10mL溶液，用濃度為1mol/L HCl或NaOH將溶液 pH調節到 3、4、5、6、7、8，然后在10000r/min離心15min，上清液中的蛋白質含量采用雙縮脲法進行測定［10］。樣品中總蛋白含量采用凱氏定氮法［7］測定。溶解性的計算公式如下：

1.2.4.2 熱穩定性的測定 稱取0.01g水解產物，用去離子水配制成10mL溶液，用濃度為1mol/L HCl或NaOH將溶液pH調節到4、7、8，然后在水浴鍋中進行熱處理（63℃、30min或93℃、30s），熱處理后立即放入0℃冰水混合物中冷卻10min，于10000r/min下離心15min。蛋白質熱穩定性以熱處理后的溶解性表示。

1.2.4.3 乳化性的測定［11］取1%的水解產物溶液3.0mL，邊攪拌邊加入花生油1.0mL，然后以10000r/min的速度高速勻漿1min制成乳濁液，用微量注射器從下部抽取0.1mL，加入9.9mL 0.1%的十二烷基磺酸鈉（SDS）溶液制成混合液，在500nm的波長下測吸光度A0。乳化活性指數（EAI）計算公式如下：

式中，T=2.303；A0為乳化完成后立即測定的吸光度；W為蛋白質含量（g，乳化前水解產物的濃度）。

1.2.4.4 起泡性的測定［12］取20mL濃度為0.5%蛋白溶液，分別將其pH調至3、4、5、6、7、8，在均質機中以23000r/min轉速攪拌1.5min，隨后立即轉入50mL的測量筒內測量攪拌后的體積。起泡性的計算公式如下：

式中，A為攪拌后的體積（mL）；B為攪拌前的體積（mL）。

2 結果與分析

2.1 草魚肉水解產物的化學組成

草魚魚肉蛋白酶解產物的化學組成如表1所示。

表1 草魚魚肉蛋白酶解產物的成分組成

2.2 水解度

采用TNBS法測定草魚魚肉蛋白的水解度，其水解度隨時間的變化如圖1所示。由圖1可知，在最初的30min內，水解速率較高，隨后水解速率逐漸降低。這與其他有關魚肉蛋白水解的研究報道中水解速率的變化趨勢相一致［13］。這一趨勢表明在最初的30min內，中性蛋白酶對草魚魚肉蛋白的水解作用最強，隨后水解體系中游離氨基酸含量增多，中性蛋白酶的水解作用逐漸受到抑制，水解速率減慢。

圖1 草魚肉蛋白酶解的水解度隨時間的變化

2.3 水解產物的功能特性

2.3.1 溶解性 pH及水解度對蛋白酶解產物溶解性的影響在國內外研究中都有報道，對黃色條紋鲹、沙丁魚副產物、鰱魚肉等酶解產物的研究［1，13-14］表明，酶解可以有效改善原料蛋白的溶解性，酶解產物在不同的pH下均具有良好的溶解性，并且隨著水解度的增加，酶解產物的溶解性增大，pH對酶解產物溶解性影響變小。對草魚魚肉蛋白酶解產物溶解特性的研究也得到了與上述報道相似的結論。

不同水解度草魚魚肉蛋白水解產物的溶解性能如圖2所示。從圖2可以看出，草魚魚肉蛋白酶解產物在pH為3～8的范圍內均具有較好的溶解性，溶解性大于82%。在pH為4時不同水解度酶解產物的溶解性均達到最低，而后隨 pH增加而增大。Quaglia［14］等在研究中指出，pH會影響酶解產物肽段的靜電荷數量，從而導致溶解性發生變化。在相同pH下水解度較高的酶解產物溶解性較好。Shahidi［15］等在研究中指出，隨著水解度的增加，水解體系中小肽的含量增多，原料蛋白中越多的極性基團被暴露，水解產物的親水性增加，因此水解產物溶解性增加。

圖2 溶液pH對草魚魚肉蛋白酶解產物溶解性的影響注：相同字母表示同一pH下中性蛋白酶酶解產物的

溶解性之間差異不顯著，P＞0.05。

2.3.2 熱穩定性 以蛋白水解產物為基料或食品添加劑的食品在其加工過程經常要經過高溫處理，蛋白質在加熱過程中分子間的各種作用力被破壞，蛋白質分子構象發生變化，疏水基團暴露，進而發生凝集，溶解性下降。因此水解產物的熱穩定性是衡量其是否適于在食品中應用的一個重要指標。

蛋白質分子經水解后肽鏈展開，親水-疏水平衡得到改善，更易與水分子形成氫鍵，因此水解產物經熱處理后不易發生分子間的凝集，溶解性可保持在較高水平。由圖3、圖4可知，在pH為4時，隨著水解度的增加，酶解產物的熱穩定性增加（P＜0.05），pH為7、8時，不同水解度酶解產物的熱穩定性差異不顯著（P＞0.05）。除DH=4.72%的水解物外，其它兩水解度的水解產物經63℃、30min，93℃、30s熱處理后均具較好的熱穩定性，溶解性保持在82%以上。趙玉紅［16］對鰱魚下腳料進行酶解，所得酶解產物也具有較好的熱穩定性。

圖3 63℃、30min熱處理條件下草魚魚肉蛋白酶解產物的熱穩定性

2.3.3 乳化性 乳化活性指數是衡量蛋白質乳化性的常用指標。草魚魚肉蛋白中性蛋白酶酶解產物在水解度為4.72%、9.80%、13.32%時的乳化性如圖5所示。水解產物的乳化性在pH為4時達到最低，而后隨著pH的增加而增大。在pH為3～5的范圍內酶解產物的乳化性隨水解度的升高而降低。

圖4 93℃、30s熱處理條件下草魚魚肉蛋白酶解產物的熱穩定性

圖5 pH對草魚魚肉蛋白酶解產物乳化活性指數的影響注：相同字母表示同一pH下中性蛋白酶酶解產物的乳化活性指數之間差異不顯著，P＞0.05。

酶解對水解產物乳化性的影響已有一些報道。蛋白質被水解后，分子內部的疏水殘基暴露，蛋白質在油-水界面吸附、擴散能力提高，乳化能力增強。Rahali［17］在研究中指出，肽段的長度和兩親性是影響酶解產物乳化性的重要因素。Klompong［1］等在有關水解度對酶解產物乳化性影響的研究中指出，較高的水解度會導致水解產物中小分子的肽和游離氨基酸含量增多，使蛋白質在油-水界面吸附、擴散的能力下降，導致乳化性有所下降。

2.3.4 起泡性 由圖6可知，中性蛋白酶不同水解度酶解產物的起泡性均在pH為4時達到最低，而后隨著pH的增加起泡性增強。與本研究相似，Klompong［1］以黃條紋鲹為原料、董士遠［13］以鰱魚魚肉為原料、Qian［18］以豬血漿蛋白為原料所得的酶解產物在溶解性最低的pH下起泡性也達最低。Qian［18］等在研究中指出，酶解產物的溶解性較差時，蛋白質無法迅速地轉移到分界面，導致酶解產物的起泡性也較弱。本研究與 Klompong［1］、董士遠［13］、Qian［19］等對酶解產物起泡特性的研究報道基本相似，在相同pH下，隨水解度的增加酶解產物的起泡性降低。這可能是因為隨著水解度增加，蛋白質分子的肽段變短、分子量下降，其在界面上的展開和重排受到影響，起泡性降低。

3 結論

3.1 Neutrase酶解草魚魚肉蛋白產物在pH為3～8的范圍內溶解性均大于82%，在pH為4時除DH= 4.72%的酶解產物外，其他兩水解度的酶解產物經63℃、30min，93℃、30s熱處理后均具有較好的熱穩定性。

3.2 在pH為3～8的范圍內酶解產物的溶解性、乳化性、起泡性隨pH的變化趨勢一致：在pH為4時達到最低，而后隨pH的增加而增大。并且在pH為3～8范圍內酶解產物的溶解性、乳化性、起泡性間存在相關性（P＜0.05）。

圖6 pH對草魚魚肉蛋白酶解產物起泡性的影響注：相同字母表示同一pH下中性蛋白酶酶解產物的起泡性之間差異不顯著，P＞0.05。

3.3 采用中性蛋白酶酶解改性的草魚魚肉蛋白功能特性良好，可作為食品基料或蛋白強化劑應用于食品工業中。

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Functional properties and quality control of protein hydrolysates from grass carp fish（Ctenopharyngodon idellus）meat

LI Xue，YOU Juan，LUO Yong-kang*
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Functional properties of protein hydrolysates from grass carp fish（Ctenopharyngodon idellus）meat，

hydrolyzed by Neutrase（NH）at 4.72%，9.80%and 13.32%of degree of hydrolysis（DH）were investigated.The solubilities，emulsion activity index and foaming capacity were the lowest at pH4.With the DH rising，the solubilities of hydrolysates increased，but the foaming capacity decreased in the pH range of 3～8.The NH displayed a lower heat stability with the DH rising at pH4（P＜0.05）.As the DH rise，the emulsion activity index decreased in the pH range of 3～5.And there were significant relationship between solubility，emulsion activity index and foaming capacity（P＜0.05）.

grass carp；hydrolysis；functional properties

TS254.1

A

1002-0306（2011）02-0081-04

我國淡水魚資源豐富，產量位居世界第一，但我國淡水魚的加工利用率卻不足10%。近些年來國內外已有一些采用酶解的方法對魚蛋白進行深加工利用的研究報道［1-4］。酶解后的魚蛋白產物是多肽、小肽和氨基酸組成的復雜體系，其與原料蛋白具有相同的氨基酸構成，而功能特性及生物活性與原料蛋白相比卻得到了一定的改善。酶解產物的功能特性受原料蛋白理化特性、水解度、所選用酶種類等的影響。因此開展魚蛋白酶解產物功能特性的研究對淡水魚的深度開發及魚肉蛋白酶解產物在食品中的應用具有重要意義。草魚（Ctenopharyngodon idellus），俗名鯇魚，蛋白質含量為15%～20%，是我國第一大淡水魚。目前國外對于草魚開發利用的研究報道較少［2，5-6］，國內對于草魚開發利用的報道側重于草魚酶解工藝、膠原蛋白提取工藝等的研究，未見對草魚魚肉蛋白酶解產物功能特性進行系統研究的報道。本研究采用中性蛋白酶提取草魚魚肉蛋白水解物，并對其溶解性、熱穩定性、乳化性、起泡性進行系統的研究，分析溶解性、乳化性、起泡性間的相關性，為擴大草魚魚肉蛋白在食品工業中的應用提供了理論依據。

2010-03-25 *通訊聯系人

李雪（1987-），女，碩士研究生，主要從事畜水產食品加工研究。

現代農業產業技術體系建設專項資金資助（nycytx-49-24）；國家自然科學基金項目（30871946）；國家科技支撐計劃（2008BAD94B06）。