蘆根多糖的分離純化和體外抗腫瘤研究

晁若瑜，楊靖亞，2，*，蔡曉曄，陸曉帆，錢媛華

(1.上海海洋大學，上海201306;2.上海海洋大學海洋科學研究院，上海201306)

蘆根多糖的分離純化和體外抗腫瘤研究

晁若瑜1，楊靖亞1，2，*，蔡曉曄1，陸曉帆1，錢媛華1

(1.上海海洋大學，上海201306;2.上海海洋大學海洋科學研究院，上海201306)

從蘆根中提取和純化了蘆根多糖，并研究其體外抗腫瘤活性。采用熱水浸提法從蘆根中提取蘆根多糖，經Sevag法脫蛋白，冷凍干燥后，葡聚糖凝膠柱層析分離純化，得到純化的蘆根多糖，苯酚－硫酸法測定多糖樣品中總糖含量，凝膠層析測定多糖分子量，細胞毒性實驗研究其體外抗腫瘤作用。結果測得蘆根多糖樣品中總糖含量為0.872%，分離純化得到三種蘆根多糖組分R－PolyⅠ、R－PolyⅡ、R－PolyⅢ，三者的分子量分別為79781、29073、10605u，細胞毒性實驗表明三種蘆根多糖組分對Hela細胞和B16細胞均具有良好的抑制作用。這為蘆根多糖在食品工業及醫藥保健等領域的應用奠定了基礎。

蘆根多糖，提取，純化，抗腫瘤

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆根 購于北京永安堂藥店，產地河北; SephadexG－100 美國Sigma公司;Dextran－T－10、T－40、T－70、T－100 瑞典Pharmacia公司;RPMI1640培養基、胎牛血清 Gibco公司;MTT 購于上海實生細胞生物技術有限公司;無水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、95%乙醇、苯酚、濃硫酸 均為分析純，購于國藥。

微波爐 WP700IP17，美的;雙列四孔恒溫水浴鍋 HWS－24，上海慧泰儀器制造有限公司;低速自動平衡離心機 TDZ4A－WS，上海滬湘儀離心機儀器有限公司;旋轉蒸發器RE－52A、恒流泵BF－100上海青浦滬西儀器廠;循環水多用真空泵SHZ－3、層析柱(1.6×40cm) 上海滬西分析儀器廠有限公司; 721紫外分光光度計 上海越平科學儀器有限公司; CO2培養箱NAPC06500 法國JOUAN公司;酶標儀Model－680，Bio－Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆根多糖的提取 稱取干燥蘆根150g，0.5% NaHCO3溶液50℃水浴浸泡24h，室溫下，以蒸餾水洗凈蘆根。首先以料水比1∶3，大火(700W)微波提取8min，再在120℃，磁力攪拌條件下熱水浸提3h，抽濾，濾液進行減壓濃縮后，攪拌下加入950mL/L乙醇，調醇含量至650mL/L，4℃靜置過夜，離心10min (3000r/min)，棄去上清液，沉淀先后用丙酮、無水乙醇洗2次，真空干燥揮去有機溶劑即得蘆根多糖的粗品［5］。

將蘆根多糖粗品用去離子水溶解轉移至100mL燒杯中，以Sevag法去除蛋白質，加入氯仿－正丁醇(4∶1)溶液，振蕩10min，于分液漏斗萃取，保留上層萃取液，該操作重復2次。萃取液進行減壓濃縮后，攪拌下加入950mL/L乙醇，調醇含量至650mL/L，4℃靜置過夜，離心10min(3000r/min)，棄去上清液，沉淀先后用丙酮、無水乙醇洗2次，真空干燥，即得蘆根粗多糖［6］。

1.2.2 蘆根多糖的含量測定

1.2.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制 精密稱取充分干燥至恒重的10mg葡萄糖標準品，加去離子水溶解，配制100mL標準溶液，標準溶液濃度為0.1g/L。分別吸取配制好的葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL，分別加去離子水至2mL，加入5%的苯酚溶液1mL，搖勻后迅速加入5mL濃硫酸顯色，振蕩5min，在沸水浴上加熱15min，取出后于冷水浴中冷卻30min。以空白為參比，用紫外分光光度計在490nm處測定吸光度值。

1.2.2.2 蘆根多糖的含量測定 取蘆根多糖100.0mg置于100mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。準確吸取0.25、0.5、1.0mL分別置于10mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。精密吸取上述溶液各1.0mL，按葡萄糖標準曲線項下操作，測定吸收度。

1.2.3 蘆根多糖的分離純化 選取1.6cm×40cm凝膠層析柱，有效長度為35cm，床體積為80mL。以0.1mol/L NaCl溶液對Sephadex G－100凝膠進行預處理。將冷凍干燥好的蘆根多糖溶于0.1mol/L NaCl溶液中，制成50mg/mL的蘆根多糖溶液。準確吸取該溶液1.5mL上樣，以0.1mol/L NaCl溶液洗脫，調節流速，每6min收集一管，每管3mL［7］。硫酸－苯酚法逐管檢查各管洗脫液的吸光度，得三種多糖組分，見圖1，分別命名為R－PolyⅠ、R－PolyⅡ、R－PolyⅢ。收集糖反應陽性高峰，洗脫液經旋轉蒸發濃縮，經乙醇沉淀，靜置過夜后用無水乙醇及丙酮洗滌，冷凍干燥。

1.2.4 蘆根多糖的分子量測定 用Sephadex G－100 (1.6×40cm)測定蘆根多糖分子量，取T－10、T－40、T－70、T－100的標準多糖各100mg溶解后上柱，以0.1mol/L NaCl溶液洗脫，調節流速，每6min收集一管，每管3mL。硫酸－苯酚法跟蹤檢測，測出洗脫體積Ve，另以相對分子量200萬的藍色葡聚糖上柱，得外水體積V0，以Ve/V0為橫坐標，以相對分子量的對數為縱坐標得標準曲線。再以同樣的條件將蘆根多糖上柱，測定洗脫體積，在標準曲線上查出相對分子量［8］。

1.2.5 細胞毒性實驗 Hela細胞及B16細胞為華東理工大學藥學院提供，用含 10%胎牛血清的RPMI1640培養基傳代、培養。

分別接種培養至對數期的Hela細胞和B16細胞的細胞懸液于96孔板中，每孔100μL，細胞數為1× 104個/孔，置37℃、5%的CO2培養箱培養24h。藥物組每孔加100mL的不同濃度(2、4、8、10mg/mL)的三種多糖液，對照組加100μL的細胞培養液，設5個復孔。培養24h后每孔加入5mg/mL MTT 10μL，繼續培養4h，吸棄上清，每孔加入100μL二甲基亞砜，震蕩10min后用酶標儀在490nm處測定其OD值，根據公式計算細胞的生長抑制率。

抑制率(%)=(1－多糖組OD/對照組OD) ×100%［9］

圖1 蘆根多糖洗脫曲線

2 結果與分析

2.1 蘆根多糖的理化性質

蘆根多糖為白色粉末，無臭、無味，溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有機溶劑，水溶液為透明或淡黃色。苯酚－硫酸法檢測呈陽性。

2.2 蘆根多糖的含量

繪制的葡萄糖標準曲線見圖2，其線性回歸方程為y=18.412x－0.0009(r=0.9995)。測得蘆根多糖的吸光度分別為0.391、0.847、1.552。根據回歸方程求出多糖含量分別為851.4、921.0、843.4mg/g，平均含量為871.9mg/g。

圖2 葡萄糖標準曲線

2.3 蘆根多糖的分離純化

蘆根多糖經凝膠柱層析，硫酸－苯酚法測定洗脫液的吸光度后得到三種多糖組分，見圖1，分別命名為R－PolyⅠ、R－PolyⅡ、R－PolyⅢ。收集三種多糖的洗脫液經旋轉蒸發濃縮，乙醇沉淀，靜置過夜后用無水乙醇及丙酮洗滌，冷凍干燥。

2.4 蘆根多糖的分子量

四種標準多糖T－10、T－40、T－70、T－100的洗脫地指導企業生產，同時也為相似類型產品的保藏提供參考。

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Extraction，purification and anti－tumor activity of Reed Rhizome polysaccharide

CHAO Ruo－yu1，YANG Jing－ya1，2，*，CAI Xiao－ye1，LU Xiao－fan1，QIAN Yuan－hua1
(1.Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China; (2.Institute of Marine Sciences，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

The polysaccharide was extracted from Reed Rhizome，the technology of its isolation，purification and anti－tumor activity were also studied.The polysaccharide was obtained through hot water extraction，then protein was removed by means of Sevag methods and purified by Sephadex chromatography.And the vitro anti－tumor activities were analyzed with cytotoxicity.The results showed that the saccharide content of the sample was 0.872%. Three kinds of polysaccharide(R－PolyⅠ，R－PolyⅡ，R－PolyⅢ)were obtained through the isolation and purification procedure，with their molecular weight estimated as 79781，29073，10605u respectively.Besides，the three polysaccharides displayed a noticeable inhibition effect in Hela and B16 cells.It laid the foundation for the wide application of the R－Poly in such fields as food industry and health care.

Reed Rhizome polysaccharide;extraction;purification;anti－tumor

TS201.2+3

B

1002－0306(2011)12－0284－03

蘆根(Reed Rhizome)系禾本科植物蘆葦(Phragmites communis Trin.)的新鮮或干燥根莖，具有悠久的藥用及食用歷史，屬清熱瀉火藥［1］。性甘、味寒，歸肺、胃經。傳統中醫藥認為蘆根清熱生津、舒肝解郁、除煩、止嘔、利尿。主要用于熱病煩渴、胃熱嘔吐、肺熱咳嗽、肺癰吐膿、熱淋澀痛等的治療。在多本草藥圖志及醫家經典中有所記載。蘆根中含有多種化學成分，現代研究發現蘆根含有51%的糖類、5%的蛋白質、1%的脂肪及多種有機酸、維生素和微量元素［2］，其中以多糖成分為近年來的研究熱點。研究表明，蘆根多糖具有一定保肝作用［3－4］，但目前對于蘆根多糖的理化性質及活性等方面尚未有系統而全面的研究。筆者在前期實驗的基礎上，對蘆根多糖的理化性質和體外抗腫瘤作用進行研究分析，希望能夠為探索其作為新藥品基料及食品功能性成分資源的可行性提供依據，并為蘆根的綜合利用提供理論基礎。

2011－08－25 *通訊聯系人

晁若瑜(1986－)，女，在讀碩士，研究方向:海洋藥物。

上海市教育委員會科研創新項目(09YZ265);上海市教育委員會重點學科建設項目(J50704)。