HPLC內標法同時測定十三香中胡椒堿和6-姜酚的含量

林先哲，郭墨婷，吳珍菊，呂夢莎，黃雪松

(暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州510632)

HPLC內標法同時測定十三香中胡椒堿和6-姜酚的含量

林先哲，郭墨婷，吳珍菊，呂夢莎，黃雪松*

(暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州510632)

目的:建立快速、準確并同時測定十三香中姜酚和胡椒堿含量的方法。方法:采用 HPLC法，色譜柱為Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為乙腈-水梯度洗脫，流速1mL/min，檢測波長280nm。結果:內標法與標準曲線法的測定結果一致;胡椒堿在5～160μg/mL、姜酚和姜酚肟在20～640μg/mL時，峰面積與濃度呈良好線性關系;相關系數分別為0.9995、0.9997、0.9995。十三香中胡椒堿和姜酚的含量分別為:20.23、4.33mg/g。結論:用姜酚肟做內標測定產品中姜酚和胡椒堿的方法既不用重復做標準曲線，又可同時測定兩種成分的含量。

胡椒堿，姜酚肟，姜酚

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無水甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純) 購自迪瑪科技;水 經過濾后的純凈水;胡椒堿 購自西安華萃生物技術有限公司，純度為98%;6-姜酚標樣 購自日本WAKO公司，純度大于98%;6-姜酚肟標樣實驗室自制［16-17］，經歸一化法測定其純度＞95%;樣品 某市售十三香粉。

LC-20AT高效液相色譜儀(配備SPD-M20A光電二極管陣列檢測器、Class-vp色譜工作站) 日本島津公司;超聲波振蕩器 江蘇宏華儀器廠; SK3310LHC水浴恒溫振蕩器 上海科導超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 胡椒堿標準溶液的配制 精確稱取胡椒堿標準品0.016g，置于100mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，配成160μg/mL的標準儲備液。精確量取該儲備液，倍比稀釋成160、80、40、20、10、5μg/mL的系列標準溶液。

1.2.2 6-姜酚標準溶液的配制 精確稱取6-姜酚標準品0.064g，置于100mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，配成640μg/mL的標準儲備液。精確量取該儲備液，倍比稀釋成640、320、160、80、40、20μg/mL的系列標準溶液。

1.2.3 6-姜酚肟標準溶液的配制 精確稱取6-姜酚肟標準品0.064g，置于100mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，配成640μg/mL的標準儲備液。精確量取該儲備液，倍比稀釋成640、320、160、80、40、20μg/mL的系列標準溶液。

1.2.4 供試品溶液的配制 取某市售2.00g十三香粉，置于50mL容量瓶中，加入乙醇50mL并放入30℃恒溫搖床2h，放冷后再定容，過濾待測。

1.3 HPLC測定條件

色譜柱：Diamonsil(TM)C18柱，250mm×4.6mm，5μm;流動相：A，水;B，乙睛;流速1mL/min;柱溫：室溫;檢測波長280nm;進樣體積20μL。

表1 HPLC梯度洗脫程序

2 結果與分析

2.1 線性關系的考察

取1.2.1，1.2.2，1.2.3所配系列標準溶液進行HPLC測定，進樣量均為20μL。每個濃度測定3次，峰面積取平均值。以標準溶液質量濃度(X，μg/mL)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線。胡椒堿的線性回歸方程Y=4.143X×104-5913，(R2= 0.999，n=6);姜酚的線性回歸方程Y=7.51X ×103+26016，(R2=0.999，n=6);姜酚肟的線性回歸方程Y=9.68X×103+24592，(R2=0.999，n=6)。結果表明其相關程度高，能夠反映胡椒堿、姜酚、姜酚肟濃度與各自峰面積的關系。胡椒堿在質量濃度5～160μg/mL，姜酚在質量濃度20～640μg/mL，姜酚肟在質量濃度20～640μg/mL時峰面積與濃度呈良好的線性關系。按一定比例混合三種標準溶液繪制標準對照圖，見圖1。

2.2 精密度實驗

取胡椒堿、6-姜酚、6-姜酚肟標準溶液各一份，重復進樣5次，測得峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.9%、0.6%和0.8%，該誤差在儀器分析誤差范圍之內。

2.3 姜酚肟回收率的測定

圖1 三種標準溶液標準對照圖

在供試品中加入已知量的6-姜酚肟，進行回收率測定，測定結果如表2。結果表明：用6-姜酚肟做內標測定樣品中6-姜酚及胡椒堿含量時，6-姜酚肟穩定，不與其他物質反應，符合內標的要求。

2.4 相對校正因子的測定

精確量取6-姜酚肟標準溶液，分別與胡椒堿、6-姜酚標準溶液混合;再按照倍比稀釋逐級稀釋5次，進樣量20μL，重復以上步驟6次，峰面積取平均值，得到胡椒堿對6-姜酚肟的相對校正因子(fi/fs)及6-姜酚對6-姜酚肟的相對校正因子(fj/fs)，測定結果見表3。

該表數據顯示，相對校正因子(fj/fs)與前人所得的6-姜酚對6-姜酚肟的相對校正因子相同;但因色譜柱，檢測條件等不同，從而導致回歸方程有所差異［18］。

2.5 樣品測定

取1.2.4所配溶液8mL，加入2mL內標物6-姜酚肟(640μg/mL)，進行HPLC檢測。其HPLC圖見圖2。重復三次，并分別進行內標法和外標法計算胡椒堿和6-姜酚的含量，其結果見表4。

圖2 樣品HPLC圖

表4 內標法和外標法比較(mg·g-1)

表4結果經過F檢驗和t檢驗(置信度95%)，兩種方法沒有顯著差異，不存在系統誤差。

3 結論

通過回收率、精密度等指標檢查以及與6-姜酚、胡椒堿外標法的比較，證實以6-姜酚肟為內標同時測定樣品中的6-姜酚及胡椒堿是可行的。采用內標法測定這兩種物質的含量，既不用重復作標準曲線，又可以避免由于胡椒堿和姜酚標樣不穩定導致的誤差，而且本實驗的檢測條件能同時測定產品中兩種物質的含量;從而達到節省時間和試劑、降低檢測成本和誤差的目的。

表2 回收率實驗結果

表3 相對校正因子

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Simultaneous determination of piperine and 6-gingerol in condiment by HPLC internal standard method

LIN Xian-zhe，GUO Mo-ting，WU Zhen-ju，LV Meng-sha，HUANG Xue-song*
(Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

The content of piperine and 6-gingerol in condiment were investigated by RP-HPLC with Diamonsil column(C18，5μm，250mm×4.6mm)at room temperature and 280nm.The mobile phase was water-methanol (gradient elution)with flow rate of 1mL/min.The 6-gingerol oxime was used as the internal standard.There was no distinct difference between the external standard method and internal standard method.The result showed that the linear range of piperine was 5～160μg/mL，while 6-gingerol and 6-gingerol oxime were 20～640μg/mL.The correlation coefficient were 0.9995，0.9997 and 0.9995，respectively.This condiment contained 20.23mg/g piperine and 4.33mg/g 6-gingerol.These results concluded that the method had no need to make standard curve duplicatly and can detect piperine and 6-gingerol simultaneously.

pipperjine;6-gingerol;6-gingerol oxime

TS207.3

A

1002-0306(2011)12-0452-03

十三香粉由胡椒、干姜、肉桂等十三種香料組成，治療脾胃受寒、中陽不振、脘腹冷痛、寒瀉冷痢、產后氣血阻滯、少陰沉寒、浮熱牙疼等癥［1］。其中姜酚類物質(如6-姜酚)為干姜的主要有效成分，有抑制前列腺素合成、防腐殺菌、驅蟲、護膚美容等多種功能［2-3］。胡椒堿為胡椒的主要辣味物質，有抗炎、治療胃潰瘍、降血脂、抗癌、鎮痛、鎮靜、抗驚厥、殺蟲等活性［4-5］。由于胡椒堿和姜酚都容易受酸、堿、熱等因素影響而被破壞［6］;要同時測定十三香等混合香料中這兩種物質的含量時，按照前人所用檢測條件［7-9］，不足以使胡椒堿和6-姜酚出峰效果清晰。而Rai P D同步測定烏頭堿、龍葵堿、胡椒堿［10］及Verma同步檢測姜黃素、胡椒堿和麝香草酚［11］時，均使用在不同時間段變波長的方法達到檢測目的。然而該方法波峰雖然明顯，但波峰之前分離不開，會相互影響。本實驗研究利用姜酚肟做內標［12-13］，根據有關研究［14-15］的檢測條件加以改良，以便同時測定十三香中胡椒堿和姜酚含量。

2010-12-13 *通訊聯系人

林先哲(1985-)，男，碩士研究生，研究方向:功能食品。

廣東省高校科技成果產業化項目(cgzhzd0806);農業部公益項目(200903018)。