正交試驗法優選消渴降糖顆粒的提取工藝

李 勇

（廣東藥學院藥物研究所/廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州510006）

正交試驗法優選消渴降糖顆粒的提取工藝

李 勇

（廣東藥學院藥物研究所/廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州510006）

目的優選消渴降糖顆粒的提取工藝。方法采用正交試驗設計，以HPLC測定人參皂苷Rg1、鹽酸小檗堿含量、總固體得率為指標優選提取工藝條件。結果優選人參、黃連提取工藝為以70%乙醇6倍量、提取3次，每次1.5h。結論所優選工藝條件合理可行、穩定，為該藥的開發奠定了基礎。

消渴降糖顆粒；提取工藝；正交試驗；人參；黃連

消渴降糖顆粒由人參、黃連、地黃等藥物組成，具有益氣養陰、清熱潤燥，養血活血作用，用于治療屬氣陰兩虛、瘀熱互結之2型糖尿病。方中人參中含有皂苷類、人參多肽類等成分，具有明顯調節機體糖代謝的作用[1-4]，與胰島素合用，可減少胰島素劑量，延長降血糖作用時間。黃連中含有小檗堿、甲基黃連堿等生物堿，實驗證明小檗堿可降低正常小鼠、環氧嘧啶型糖尿病小鼠和自發性糖尿病小鼠的血糖，改善小鼠的葡萄糖耐受量、明顯改善糖尿病患者的血液流變學作用[5,6]。原工藝以水提取，在制備和使用上有諸多不便，活性成分提取率較低。本文以人參皂苷Rg1含量、鹽酸小檗堿含量為指標，采用正交試驗設計，對人參、黃連的醇提工藝條件進行了優選。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Dionex ultimate 3000高效液相色譜儀（美國）；KQ-250型醫用超聲波清洗機（昆山超聲儀器有限公司）；LD4-2型離心機（北京醫用離心機廠）；RE-52A旋轉蒸發器（上海嘉鵬科技有限公司）；AE-240S型電子分析天平（瑞士METTLER）；0～100（%VOL）酒精計（河北滄州雙華儀表廠）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿（110713-200208）、人參皂苷Rg1（0703-200221），中國藥品生物制品檢定所提供；人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey的干燥根，黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch的干燥根莖，以上藥材均購自廣州致信中藥飲片有限公司，符合藥典規定；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 人參、黃連單提、合提對比

2.1.1 人參、黃連單獨提取樣品溶液的制備

2.1.2 人參、黃連復方合提樣品溶液的制備

稱取人參30g、黃連20g，置圓底燒瓶中，加70%乙醇7倍量，加70%乙醇7倍量，加熱回流2次，每次1.5h，提取液過200目濾布，合并濾液，定容至500mL，作為樣品溶液Ⅲ，備用。

2.1.3 人參皂苷Rg1含量測定

2.1.3.1 色譜條件

色譜柱：DIONEX Acclaim 120 C18（250×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.05%磷酸（19.7∶80.3）；檢測波長：203nm；柱溫：30 ℃。

2.1.3.2 對照品溶液制備

精密稱取人參皂苷Rg1對照品8.10mg，加甲醇制成每1mL含人參皂苷Rg1 0.405mg的溶液，即得。

2.1.3.3 供試品溶液制備

精密吸取樣品溶液Ⅰ、Ⅲ各50mL，水浴蒸干，殘渣加水25mL使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次25mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別作為供試品溶液Ⅰ、供試品溶液Ⅱ。

2.1.3.4 標準曲線繪制

分別精密吸取2.1.3.2項下對照品溶液0.05、0.15、0.25、0.50、0.75、1.0mL，分別置于1mL量瓶中，加甲醇稀釋到刻度，搖勻，照上述色譜條件測定，以峰面積積分值為縱坐標（Y），以人參皂苷Rg1微克數為橫坐標（X），計算回歸方程 Y＝5.9332X＋0.0192，r＝0.9999，表明人參皂苷Rg1在0.405～8.100μg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.1.3.5 含量測定

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液Ⅰ、Ⅱ各20 μL注入液相色譜儀中，測定人參皂苷Rg1色譜峰面積，計算其含量（表1）。

2.1.4 鹽酸小檗堿的含量測定

2.1.4.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%十二烷基磺酸鈉磷酸溶液（52∶48）；檢測波長：265nm；柱溫：30℃。

2.1.4.2 對照品溶液制備

精密稱取鹽酸小檗堿10.80 mg，加甲醇1mL含鹽酸小檗堿0.1080mg的溶液，即得。

2.1.4.3 供試品溶液制備

精密吸取樣品溶液Ⅱ、Ⅲ各1mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別作為供試品溶液Ⅲ、供試品溶液Ⅳ。

2.1.4.4 含量測定

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液Ⅲ、Ⅳ各5μL注入液相色譜儀中，測定人參皂苷Rg1色譜峰面積，計算其含量（表1）。

2.1.4.5 標準曲線繪制

分別精密吸取2.1.4.2項下對照品溶液0.05、0.10、0.15、0.25、0.50、0.75mL，分別置于1mL量瓶中，加甲醇稀釋到刻度，搖勻，照上述色譜條件測定，以峰面積積分值為縱坐標（Y），以鹽酸小檗堿微克數為橫坐標（X），計算回歸方程 Y＝68.6700X－0.1329，r＝0.9999，表明鹽酸小檗堿在0.108～1.62μg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系（表1）。

表1 人參、黃連單提與合提結果比較

由表1可知，人參皂苷Rg1、鹽酸小檗堿的相對提取率均高于人參，黃連單獨提取，結合大生產，確定人參、黃連合提，并采用正交試驗設計進一步對人參、黃連的提取工藝條件進行優選。

2.2 人參、黃連復方合提工藝研究[7,8]

2.2.1 正交實驗設計

以人參皂苷Rg1、鹽酸小檗堿及總固體得率為指標，采用正交試驗對影響提取效率的醇濃度、提取時間、溶劑用量、提取次數等因素進行優選，試驗設計見表2。

表2 提取工藝因素水平表

2.2.2 數據分析

以人參皂苷Rg1、鹽酸小檗堿和總固體得率為指標考察四個因素，影響提取效率的因素依次為提取次數＞乙醇濃度＞提取時間＞加液量，較優的工藝方案為人參、黃連以70%乙醇6倍量回流提取3次，每次1.5h，結果見表3。

2.3.3 比較驗證試驗

因提取時間在第3個水平，故進行比較驗證試驗，稱取人參30g，黃連20g，分別按表4條件進行提取，依法測定人參皂苷Rg1、鹽酸小檗堿及總固體得率，由表4可知，提取時間1.5h與2h，人參皂苷Rg1、鹽酸小檗堿均無明顯差異，且各批樣品指標成分均高于正交試驗最大值，表明優選的工藝條件合理、可行、穩定。

3 討 論

3.1 鹽酸小檗堿易溶于熱水和熱乙醇，而在冷水、冷乙醇中溶解度降低，故在提取后需趁熱抽濾，以減少成分損失。

3.2 在預實驗中，人參、黃連分別以水和乙醇作為提取溶劑，以人參皂苷Rg1、鹽酸小檗堿為指標考察，結果表明醇提效率較高，故選用乙醇回流提取。工藝中人參、黃連以乙醇合提，符合傳統中醫藥理論，簡化工藝，降低了成本，而且各藥材都具有較高的提取效率，適合工業生產需要，驗證試驗結果表明本工藝合理可行。

表3 人參、黃連L9（34）正交試驗及結果

表4 人參、黃連合提驗證實驗結果

[1]孫冬梅.人參對糖尿病大鼠的降糖調脂作用[J].長春醫學,2009,7(1):1-3.

[2]李莉芬,王世東,姜淼,等.人參黃連對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠糖脂代謝的影響[J].中國中醫基礎醫學雜志,2006,12(9):707-708.

[3]田春雨,薄建柱,薄海美,等.單味中藥中有效成分治療糖尿病研究進展[J].時針國醫國藥,2010,21(2):432-433.

[4]包天桐.人參總皂甙對小鼠四氧嘧啶糖尿病的影響[J].藥學學報,1981,16(8):618-619.

[5]王增四.小檗堿促進胰島素分泌改善胰島素抵抗的分子機制[D].武漢:華中科技大學,2009:5-15.

[6]榮太梓,陸付耳,陳廣,等.小檗堿對胰島素分泌缺陷型糖尿病大鼠葡萄糖激酶相關糖代謝的影響[J].中草藥,2007,38(5):725-728.

[7]謝麗玲,任理,賴縣生,等.紅參中人參總皂苷的提取純化工藝研究[J].中藥材,2009,40(10):39-41.

[8]張啟云,徐國良,孫立波,等.正交設計法優化黃連總生物堿的提取工藝[J].江西中醫學院學報,2010,22(3):19-20.

R282.710.2

B

1671-8194（2011）26-0219-03