明膠摻假乳制品快速檢測方法的建立

魏戰峰，田忙雀，王 玥，楊水云

(1.咸陽市疾病預防控制中心，陜西 咸陽 712000；2.西安市糧油質量檢驗中心，陜西 西安 710003；3.西安交通大學生命科學與技術學院，陜西 西安 710049)

明膠摻假乳制品快速檢測方法的建立

魏戰峰1，田忙雀2，王 玥3，楊水云3

(1.咸陽市疾病預防控制中心，陜西 咸陽 712000；2.西安市糧油質量檢驗中心，陜西 西安 710003；3.西安交通大學生命科學與技術學院，陜西 西安 710049)

目的：建立一種明膠摻假乳制品的快速定性方法。方法：采用硝酸汞溶液沉淀乳蛋白，進一步用苦味酸溶液檢測明膠，通過敏感度測定試劑用量。結果：用1.4g/100mL硝酸汞溶液沉淀乳蛋白的最佳用量為乳品體積的1/2；用苦味酸檢測明膠的敏感度為30mg/100mL。結論：該方法快速、方便，靈敏度高，可做成試劑盒，滿足實際樣品檢測要求。

摻假乳；明膠檢測；試劑盒

目前，鮮牛乳摻假的現象越來越嚴重，這不但影響產品的質量，使乳品廠陷入困境，也嚴重侵害了消費者的利益[1-2]。為此，很多乳品廠都加強了鮮奶收購的管理與監督。

明膠是膠原蛋白的水解產物[3]，而膠原蛋白則是動物體內含量最豐富的蛋白質。其來源廣泛，水解工藝粗放廉價，很易取得[4-5[6-7]，屬于不完全蛋白，不能提供足夠的營養價值。乳中加入廉價的明膠能提高乳蛋白和非脂固體的含量，增加假乳的密度和比重[8-9]，以掩蓋牛乳摻水的本質[2,10]，而現行國標法(凱氏定氮法)卻無法檢出。因此，為了加強牛乳的衛生監督和管理，必須正確快速判斷原料奶中有無摻入明膠。

常規的明膠檢測方法是首先將明膠完全水解之后檢測其中特有的羥脯氨酸的存在與含量[4,11-13]，該法要求條件高且耗時長，不適宜開發成便攜式快速檢測產品。據報道[14]，用硝酸汞和苦味酸可以分步沉淀乳制品中的乳蛋白和明膠，從而對牛乳中有無明膠的存在進行定性檢測。但此法僅限于粗糙的描述沒有細化檢測條件，也沒有形成檢測產品。本研究旨在建立乳制品中明膠的定性檢測方法，并形成便攜的試劑盒產品，使市場上和原料奶收購中明膠摻假乳品的快速定性檢測成為可能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

液態純牛奶 銀橋乳品廠。

1.4g/100mL硝酸汞(分析純)；2,4,6-三硝基苯酚(化學純)；3g/L明膠(化學純)；250g/L硝酸銀(分析純)；濃硝酸(65%～68%)。

硝酸汞溶液：7g硝酸汞，50mL去離子水，加濃硝酸1.25mL，加熱全溶解后加去離子水至500mL；飽和苦味酸溶液：2g苦味酸加去離子水至100mL，煮沸，冷卻至室溫，待有結晶析出時，倒出上清液待用；明膠母液：3g明膠加100mL去離子水，淡黃色半透明溶液，微波加熱中高火1min至溶解；硝酸銀溶液：5g硝酸銀溶解于20mL去離子水中，微熱，攪拌至溶解完全；稀硝酸溶液：0.25mL濃硝酸加50mL去離子水。

1.2 敏感度的測定

用硝酸汞溶液沉淀乳蛋白，進一步用苦味酸溶液檢測明膠。通過敏感度測定來決定試劑用量，配制不同濃度梯度的明膠摻假牛奶，加硝酸汞溶液，離心后取上清液加飽和苦味酸溶液。與陰性對照做對比，觀察溶液是否變渾濁。變渾濁者為陽性，仍保持透明清亮者為陰性。以能使溶液變渾濁的明膠最低加入量為明膠檢測的下限，即敏感度。

1.3 實驗條件的優化

1.3.1 硝酸汞用量

在第一步沉淀反應中，如果硝酸汞用量不足，將不能完全沉淀乳蛋白，使上清液不能澄清而造成假陽性。為了避免假陽性出現，必須尋找能夠沉淀最大乳蛋白含量的硝酸汞用量，以保證假乳中的乳蛋白徹底沉淀。取不同量的硝酸汞溶液，分別加入等量純牛奶中，離心沉淀后比較各上清液澄清度。取能使上清液完全澄清的硝酸汞最低加入量作為其最適添加量。

1.3.2 離心條件

尋求最低的離心轉速和時間，可以使該產品在實際應用中得到更為寬泛粗放的離心條件。以標準試劑體系和模擬假乳的加入量，在不同條件下離心。取能夠達到實驗要求的最低離心轉速和最短時間為最適離心條件。

2 結果與分析

2.1 方法敏感度的測定

在含有不同量明膠模擬假乳的試管中加入硝酸汞沉淀乳蛋白后，取各上清液，加入等量苦味酸，觀察生成沉淀情況，結果見表1。

表1 敏感度測定中明膠的不同摻入量與實驗現象Table 1 Experimental phenomena corresponding to varying amounts of glutin in simulated adulterated milk samples

由表1可知，3號管有明顯的混濁和沉淀發生，而4號管溶液清亮不能檢出明膠存在，因此估計3號管中的明膠水平為該方法的檢測下限，即敏感度，因此本方法檢測明膠的下限不高于30mg/100mL。可見本方法具有相當高的敏感度，足以滿足摻假乳制品中明膠的檢出。

2.2 實驗條件的優化

2.2.1 消除假陽性的硝酸汞用量優化

在等量純牛奶中加入不同量的硝酸汞溶液，離心沉淀后比較各上清液澄清度。硝酸汞溶液加入量和實驗觀察結果如表2所示。

表2 硝酸汞用量測試結果Table 2 Selection of optimum amount of Hg(NO3)2 solution addition μL

從表2可知，5號管中硝酸汞用量為能使乳蛋白完全沉淀的最低用量，依此比例關系配備試劑盒中試劑。而管6、7中的硝酸汞用量不足，不能使乳蛋白完全沉淀而可能造成后期檢測的假陽性，因此確定管5中的硝酸汞用量為檢測用最低用量。因此取牛乳量1/2體積的1.4g/100mL硝酸汞溶液，就能使純奶乳蛋白完全沉淀，而假乳中乳蛋白含量不會超過純乳中乳蛋白含量，故此量的硝酸汞溶液也能使假乳上清液完全澄清。

2.2.2 離心條件的優化

在不同離心條件下離心，目測離心后上清液的澄清度，得到如下兩種最適離心條件：5000×g離心30s，或者1100×g離心3min。

2.3 檢測方法說明及實際樣品測定

試劑盒使用說明如下：取500μ L待測乳制品于1.5mL離心管(盛有250mL試劑1)中，顛倒混勻。10000r/min離心30s，取上清液100μL于試劑2中。顛倒混勻，觀察結果。與陰、陽性對照進行對比，如果試管中溶液為與陰性對照相似的澄清淡黃色溶液，說明所測乳品中不含明膠；如果試管中溶液為與陽性對照相似的混濁樣黃色溶液，說明所測乳品中含有明膠。本試劑盒中試劑，除過對照可以反復借鑒使用外，其余試劑為一次性使用產品，不得反復使用，否則不對結果負責。本品能檢測出明膠摻假量在300mg/L以上的假乳制品。

試劑盒對實際樣品的檢測結果如圖1所示，表明檢測效果明顯。

圖1 試劑盒檢測結果Fig.1 Detection of glutin-adulterated milk by a reagent kit developed based on this method

3 討論與結論

牛乳主要成分酪蛋白具有良好的乳化性，即在細小的酪蛋白顆粒表面包裹了一層水化膜，從而使大顆粒的蛋白穩定懸浮于乳品中。當加入金屬鹽離子(汞離子)后，鹽離子將會破壞酪蛋白顆粒表面的水化膜，從而使酪蛋白顆粒互相聚合而沉淀。而明膠本身是水溶性的，分子質量比酪蛋白又要小得多，鹽離子對其影響小，不會使明膠沉淀。

苦味酸即2,4,6-三硝基苯酚，是一種有機酸，具有與三氯乙酸、水楊酸、鞣酸、過氯酸等相似的蛋白沉淀作用，被稱為生物堿試劑，即植物體內具有顯著生理作用的含氮堿性化合物，是能沉淀生物堿或與其產生顏色反應的物質。生物堿試劑與蛋白質的堿性基團(氨基、亞氨基、羥基、胍基等)反應。而明膠常見的三肽單元Gly-Pro-Hyp，其中脯氨酸含有側鏈氨基，羥脯氨酸含有一個亞氨基。 苦味酸與明膠的這些堿性基團反應，從而沉淀明膠。

本實驗成功研制了一種便攜式快速檢測明膠摻假乳制品的方法，進行一次乳品檢測只需4min左右，所形成產品形式為試劑盒。1個份次的試劑由分別盛有硝酸汞(試劑1)和苦味酸溶液(試劑2)的2支離心管組成，每個試劑盒配備陰、陽性對照管各一只。按照顧客對所需要檢測的乳品份次，可靈活配備試劑盒中的試管數量。

本產品的形成尚需要配備離心機設備。在以后的方法改良中，還可以嘗試過濾方法去除乳蛋白而檢測濾液中是否有明膠存在以省卻離心機；所用試劑為毒性試劑，可以進一步研發對環境和人體無毒的綠色試劑。

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Development of A Rapid Detection Method for Glutin-adulterated Milk

WEI Zhan-feng1，TIAN Mang-que2，WANG Yue3，YANG Shui-yun3
(1. Xianyang Center for Disease Control and Prevention, Xianyang 712000, China；2. Cereals and Oils Quality Test Center of Xi’an, Xi’an 710003, China；3. College of Life Science and Technology, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710069, China)

Objective: To develop a method for the rapid qualitification of glutin-adulterated milk. Methods: For the precipitation of milk proteins, Hg(NO3)2 solution was used, and the supernatant resulting from centrifugation was then added with saturated picric acid solution. After thorough mixing, whether or not the reaction system becomes turbid was identified by comparison with a negative control. The sensitivity of the established method was evaluated by using simulated adulterated milk samples with varying amounts of glutin. Meanwhile, Hg(NO3)2 solution amount and centrifugation conditions were optimized. Results: Addition of a half volume of 1.4 g/100 mL Hg(NO3)2 solution to milk samples provided optimum precipitation of milk proteins. The detection sensitivity of the method for glutin was 300 mg/100 mL. Conclusion: This method is rapid, convenient and highly sensitive, and has the potential to be developed into reagent kit products, which can meet the requirements for detection of real samples.

adulterated milk；glutin；reagent kit

TS207.3

A

1002-6630(2011)04-0220-03

2010-03-25

魏戰峰(1963—)，男，副主任技師，學士，主要從事微生物檢驗研究。E-mail：wzf5625@126.com