直接蒸餾/4-氨基安替比林法檢測淡水魚體內揮發酚的含量

王紅梅，李小定,*，熊善柏,2，付 娜，胡 芬

(1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；

2.國家大宗淡水魚加工技術研發專業分中心(武漢)，湖北 武漢 430070)

直接蒸餾/4-氨基安替比林法檢測淡水魚體內揮發酚的含量

王紅梅1，李小定1,*，熊善柏1,2，付 娜1，胡 芬1

(1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；

2.國家大宗淡水魚加工技術研發專業分中心(武漢)，湖北 武漢 430070)

確定對淡水魚中揮發酚進行提取、檢測的最優條件，并得出一種能準確檢測魚體中揮發酚含量的可靠方法。采用蒸餾水代替無酚水，用硬脂酸做消泡劑，采用100g/L NaOH溶液固定魚樣品中的揮發酚，用硫酸酸化再用直接蒸餾法提取魚體中揮發酚，并用4-氨基安替比林染色法檢測魚體中揮發酚。結果表明：本方法的線性范圍為0.002～6mg/L，檢出限為0.05mg/kg，回收率為98.4%～107.0%。與傳統檢測方法比較，該方法操作簡便、省時節能，適于推廣。

揮發酚；淡水魚；蒸餾；萃取；4-氨基安替比林

揮發酚是指能與水蒸氣一起蒸出的酚，通常認為沸點在230℃以下為揮發酚(一般為一元酚)，沸點在230℃以上為不揮發酚。揮發酚對環境和人體的危害極大。當水中含揮發酚0.1～0.2mg/L時該水中養殖出的魚肉便有異味，大于5mg/L時魚會中毒死亡。而人體長期飲用被揮發酚污染的水后可引起頭痛、出疹、瘙癢、貧血及各種神經系統癥狀[1]。近幾年，國內外關于揮發酚污染事件層出不窮(如2009年7月的鹽城市自來水事件，2009年6月南莊鎮巷心村河涌遭酚類污染，2008年佛山市陶瓷酚水事件等)。揮發酚已成為水體環境的一個極其嚴重的污染物。水中酚類主要來自煉油、煉焦、煤氣洗滌、造紙、合成氨、木材防腐和化工等行業的廢水及醫院污水[2]。

近來研究表明，水產品中過量的酚能影響水產品血液中的各項酶活性[3]，酚能通過改變鏈接蛋白位置來對人體腸道上皮細胞的功能產生阻礙作用[4]。另外，還有研究顯示酚能抑制腸道乳酸菌的活性[5]。由此看來，揮發酚對人類的危害需引起廣泛重視。因此，建立一種操作簡便，適于推廣的檢測魚體中揮發酚含量的方法勢在必行。

目前，采用直接蒸餾法獲得含揮發酚的水溶液然后用4-氨基安替比鄰法檢測淡水魚體中揮發酚，無論是在蒸餾還是在萃取、比色過程中都存在諸多因素影響揮發酚檢測的準確性[6]。本研究中對采用4-氨基安替比林法檢測淡水魚體內揮發酚的過程中各種可能影響其檢測準確性和效率的環節進行優化，從而提高魚體中揮發酚檢測的效率和準確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

各種淡水魚為市購，買后即時檢測(如需保存則需于－20℃條件下保存不超過7d)。

苯酚、NaOH等均為分析純。

1.2 儀器與設備

722型可見分光光度計 天津市普瑞斯儀器有限公司；500mL全玻璃蒸餾器、500mL碘量瓶、500mL帶刻度梨形分液漏斗和500mL可調溫電熱套。

1.3 溶液的配制

緩沖液：稱取20g NH4Cl溶于100mL氨水中，pH 10.7、4℃冷藏；2% 4-氨基安替比林溶液：稱取2g 4-氨基安替比林(C11H13N3O)溶于水中，稀釋至100mL，4℃冷藏，可使用1周；8%鐵氰化鉀溶液：稱取8g鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])溶于水中，稀釋至100mL，4℃冷藏，可使用1周；高質量濃度苯酚標準儲備溶液[7]：迅速稱取1.0 00 0 g無色重蒸苯酚溶于蒸餾水中，定容至500mL，配制成2.00g/L高質量濃度苯酚標準儲備溶液，4℃避光保存至少可以穩定1個月；苯酚中間液：吸取5.0 0 m L上述苯酚標準儲備溶液，用蒸餾水定容至1000mL，配制成10mg/L苯酚中間液，現用現配；苯酚標準使用液：吸取10.00mL上述苯酚標準儲備溶液，用蒸餾水定容至100mL，配成1μg/L標準使用液，2h內使用。

1.4 標準曲線回歸方程制作

分別吸取1.00μg/mL酚標準使用液0.00、0.50、1.00、3.00、5.00、7.00、10.00、15.00mL置于預先盛有100mL蒸餾水的500mL分液漏斗中，然后再加水至總體積為250mL，混勻。向各分液漏斗中加入2.0mL緩沖溶液，混勻，加入2mL 2g/100mL 4-氨基安替比林溶液，混勻，再加入1.5mL 8g/100mL鐵氰化鉀溶液，使之充分混合，然后靜置10min，加入10mL三氯甲烷，劇烈振搖2min(邊振邊放氣)，靜置，待明顯分層后，用濾紙擦干分液漏斗頸部內的水珠，然后用一小團濾紙塞進分液漏斗的頸部，最后把氯仿層通過分液漏斗頸部的濾紙團過濾放入比色皿中。在460nm波長處，用1cm比色皿比色。

1.5 樣品前處理

將從市場上買的魚去鱗去皮后取魚背肌肉，然后用絞肉機將魚背肌肉絞碎，于－20℃保存待測。

1.6 樣品蒸餾

稱取絞碎后的魚肌肉樣品10g左右于500mL燒杯中，加入75mL 100g/L NaOH溶液，劇烈攪拌10min，滴入3～5滴甲基橙指示劑，然后加入9.2mol/L硫酸至溶液呈橙紅色(即pH＜4)，加入100g/L硫酸銅溶液5mL，再加入一小匙硬脂酸，加蒸餾水至300mL，攪拌混勻。將燒杯內樣品液移入500mL蒸餾燒瓶中，用溫控電熱套小火加熱，同時在冷凝管端下放入一個250mL錐形瓶收集蒸餾液，收集餾出液240mL左右時停止加熱，并用蒸餾水把冷凝管中殘留的蒸餾液洗入錐形瓶直至蒸餾液達到250mL。一般蒸餾液中會含有懸浮物，過濾去除。蒸餾完畢后，檢查蒸餾殘雜液是否呈酸性，如不呈酸性則重新蒸餾并加大酸的加入量。

1.7 樣品蒸餾液的萃取和比色

將上述餾出液移入500mL帶刻度梨形分液漏斗中，然后操作方法與1.3節相同。根據魚樣品所測得的吸光度(A)，從標準曲線查得相應的揮發酚含量(x)，從而計算樣品中揮發酚的含量。

式中：A0為不加魚肉樣品蒸餾、比色所測得的吸光度即樣品空白值；a為標準曲線截距；k為標準曲線斜率；G為魚肉樣品質量/g。

1.8 數據分析

統計數據采用SAS軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 方法線性和靈敏度

本實驗方法在0.002～6mg/L范圍內線性良好，線性方程為y=0.0196x－0.0008，相關系數R2=0.9995；靈敏度即校準曲線斜率k為0.0196。

2.2 檢出限

進行11次空白實驗，經計算得批內標準差為0.005，該方法的檢測限為0.05mg/kg。

2.3 回收率實驗

表1 揮發酚檢測回收率結果Table 1 Recovery rates for phenols in fish meat with spiked standard

稱取10g左右樣品放入500mL燒杯中，向燒杯中加入不同量的揮發酚標準使用液(1.00μg/mL)，操作同1.7節和1.8節，得到回收率如表1所示。

在10g魚樣中加入1μg揮發酚標樣，揮發酚檢測回收率在102.0%～107.0%之間；加入揮發酚標準液為15μg時，揮發酚檢測回收率在98.4%～99.2%之間。由此說明，采用此方法測魚樣中揮發酚準確性較好。

2.4 樣品蒸餾的條件優化

2.4.1 實驗用水

實驗分別采用無酚水(無酚水的制備：實驗室蒸餾水中加入NaOH溶液使pH≥11(呈強堿性)，并滴加高錳酸鉀溶液至水呈紫紅色，再移入全玻璃蒸餾器中加熱蒸餾，收集蒸餾液儲存于玻璃容器中)和蒸餾水進行空白對比實驗，結果如表2所示。由表2可以看出，用蒸餾水和無酚水進行空白實驗的吸光度差別不大，但制備無酚水過程繁瑣，因此在本實驗中完全可以用蒸餾水代替無酚水。

表2 蒸餾水和無酚水空白實驗對比Table 2 Comparison of distilled water and water without phenol

2.4.2 蒸餾裝置的選擇

戰培榮等[8]和Bartak[9]采用水蒸氣蒸餾裝置研究魚體中揮發酚的檢測方法。水蒸氣蒸餾法與本研究所采用的直接蒸餾法蒸餾耗時都為90min左右，但水蒸氣蒸餾裝置連接較復雜，需兩個加熱裝置，同時加熱耗能大，故本實驗用直接蒸餾代之。本實驗采用直接蒸餾法提取魚體中的揮發酚，能得到較高的回收率和較低的檢出限。

2.4.3 防暴沸和消泡條件的選擇

在樣品蒸餾過程中若不采取任何防暴沸和消泡措施，在蒸餾后期會隨著溫度升高而產生大量氣泡，導致實驗失敗。因此，本實驗在蒸餾之前向樣品液中加入一小匙硬脂酸來做消泡劑。馬運宏等[10]用添加硬脂酸和沒添加硬脂酸的樣品在同等條件下進行實驗，結果顯示添加硬脂酸后對實驗并無顯著影響。另外，本實驗中硬脂酸的加入量只需0.5g，即每次一小匙，硬脂酸加過多易堵塞冷凝管。添加硬脂酸后的樣品在蒸餾過程中不會發生爆沸現象，因此無需添加玻璃珠或沸石來防爆沸。

2.4.4 NaOH質量濃度的選擇

在對樣品前處理時要用一定質量濃度的NaOH，此處NaOH有兩方面的作用。一是作為強堿來破壞魚的細胞組織，從而讓揮發酚更充分地進入溶液中；另外是NaOH能起到固定揮發酚的作用。羅若榮等[11]采用10g/L NaOH來浸泡魚肉樣品過夜，用這種方法雖然方便但是蒸餾過程開始后一段時間會產生大量氣泡，影響實驗的順利進行(即使加了消泡劑(硬脂酸)還會有大量氣泡生成)?？赡苁怯捎贜aOH質量濃度太低，不能完全破壞魚肉組織，致使蒸餾時產生大量氣泡。所以本實驗采用向魚肉樣品中加入100g/L NaOH 75mL然后劇烈攪拌10min，這樣既可以讓魚肉細胞組織中的酚充分溶出，又可以防止蒸餾過程中過量氣泡的產生。

2.5 實際樣品分析

抽樣選擇7種不同魚類，各取樣10g左右按本方法檢測其中揮發酚含量，結果如表3所示。

由檢測結果可以看出，實驗檢測的水產品已經受到揮發酚的污染。其中翹嘴紅鮊體內揮發酚的含量已經超出了中國漁業標準規定的值(≤0.2mg/kg)?？赡苁怯捎谝话懵N嘴紅鮊不是人工飼養，而是由湖泊中打撈，所以揮發酚含量較高。另外從檢測結果可以看出青魚、鯉魚等體內揮發酚含量較鯽魚、武昌魚高，這很可能是因為青魚、鯉魚等生活在水體的中下層(揮發酚在水體中呈垂直型遞增，下層水體含揮發酚量高于上層水體)，而且它們的飼養時間較長，導致揮發酚在體內蓄積得比鯽魚等多。由此可以看出，樣品魚中除翹嘴紅鮊體內含揮發酚超標外，其他魚雖然沒有超標，但是揮發酚含量也不少。

3 結 論

3.1 在蒸餾過程過用蒸餾水代替無酚水效果良好；用硬脂酸做消泡劑有效地消除了直接蒸餾時氣泡難以控制的缺點；而采用較高質量濃度的NaOH不僅可以幫助魚肌肉中的酚更好地溶入水中，而且能起到固定酚的作用。另外，在萃取過程中一定要注意鐵氰化鉀溶液的加入量，不得小于1.5mL，但也不得大于1.8mL[12]。也要保證4-氨基安替比林的純度以及防止其因光照而分解，對于4-氨基安替比林，可以采用苯或氯仿對其進行純化[13]。

表3 實際樣品分析結果Table 3 Analylical results of actual samples

3.2 采用直接蒸餾4-氨基安替比林法檢測魚體中揮發酚的含量具有良好的線性關系、回收率和檢出限，而且操作簡便，檢測速度較水蒸汽蒸餾法快，適于推廣。但是為了進一步提高揮發酚檢測的準確性，還可以在探索一種蒸餾過程中有助揮發酚跟其他一些難揮發組分的分離方法，以達到使蒸餾液雜質進一步減少，最后達到減少因蒸餾而引起誤差的目的[14-15]。

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Determination of Volatile Phenols in Freshwater Fish by Direct Distillation-4-Anminoantipyrine (4-AAP) Method

WANG Hong-mei1，LI Xiao-ding1,*，XIONG Shan-bai1,2，FU Na1，HU Fen1
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China；2. National Professional Sub-centers of Research and Development of Bulk Freshwater Fish Processing Technology , Wuhan 430070, China)

In order to obtain a convenient method for the determination of volatile phenols in freshwater fish, the optimal extraction and determination conditions were explored in this paper. Water without phenols was replaced by distilled water. For the elimination of foam, stearic acid was used. The fixation of phenols in fish was achieved by adding NaOH at a concentration of 100 g/L. Acidification with sulfuric acid followed by direct distillation was used for sample extraction of volatile phenols from fish. The measurement of volatile phenols was performed based on 4-anminoantipyrine (4-AAP) staining method. Results indicated that the linear range, detection limit, recovery rate of this method were 0.002－6 mg/L, 0.05 mg/kg, and 98.4%－107.0%, respectively. Compared with traditional methods, direct distillation is a convenient, time-saving and energy-saving method, which is suitable for extensive applications.

volatile；freshwater fish；distillation；extraction；4-anminoantipyrine

R155.55

A

1002-6630(2011)04-0196-04

2010-03-20

王紅梅(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為水產品營養與安全。E-mail：hongfally001@163.com

*通信作者：李小定(1968—)，男，副教授，博士，研究方向為天然產物化學。E-mail：lixd@mail.hzau.edu.cn