人骨肉瘤細胞MG-63抗失巢凋亡的機制研究*

林丁盛， 張小磊， 蔣良福， 高偉陽

(溫州醫學院附屬第二醫院骨科， 浙江 溫州 325000)

人骨肉瘤細胞MG-63抗失巢凋亡的機制研究*

林丁盛， 張小磊， 蔣良福， 高偉陽△

(溫州醫學院附屬第二醫院骨科， 浙江 溫州 325000)

目的觀察人骨肉瘤細胞(MG-63)是否存在抗失巢凋亡(anoikis)的特性，并進一步研究其分子機制。方法將MG-63細胞分別在普通6孔板和事先用聚甲基丙烯酸2-羧乙基酯(poly-HEMA)處理過的6孔板中培育24 h、48 h、72 h和7 d，人正常成骨細胞hFOB 1.19和人正常腎上皮細胞293T作對照，在光鏡、電鏡下觀察細胞的形態以及細胞間連接，用流式細胞術檢測細胞的凋亡率。通過RT-PCR方法檢測不同時期、不同生長狀態下，細胞中β-catenin和磷脂酰肌醇激酶(PI3K)的轉錄水平，并用Western blotting方法檢測細胞內β-catenin、PI3K、Bcl-2和caspase-3、8、9的蛋白表達。結果MG-63細胞在懸浮狀態下培養，細胞相互之間聚集成比較致密的團塊,沒有發生明顯的細胞凋亡(凋亡比例最高為30.29%)。在貼壁生長和懸浮生長情況下，caspase-3和caspase-9的活化水平均無顯著差異，而在懸浮狀態下caspase-8在48 h時活化最多，然后活性減低，β-catenin和磷脂酰肌醇激酶的轉錄水平比對照組高，但蛋白表達水平對照組與實驗組無顯著差異。在懸浮狀態下，Bcl-2的蛋白表達水平呈時間依賴性增長，在72 h達到最高。結論MG-63細胞具有抗失巢凋亡的特性。細胞從細胞外基質中脫離后，早期可能激活caspase-8,從而啟動并執行anoikis;Bcl-2的活化可能在后期抑制anoikis的發生。

失巢凋亡； 骨肉瘤 ； 蛋白質Bcl-2； 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8

正常的上皮細胞是黏附依賴的，它們的存活需要來自基質的信號，如果失去基質的支持，細胞會發生程序性死亡，稱為失巢凋亡(anoikis)[1-3]。失巢凋亡的意義在于防止這些脫落的細胞種植于其它不適當的地方繼續生長，然而很多容易發生轉移的惡性腫瘤細胞，從瘤體上脫落后并不發生凋亡，而且可以遷移到其它部位再次生長，這種抗失巢凋亡的現象，被認為是腫瘤發生轉移的重要原因之一。骨肉瘤是常見的惡性骨腫瘤，本文旨在研究骨肉瘤細胞是否存在抗失巢凋亡的特性，并進一步研究其分子機制，以期對骨肉瘤細胞的治療與預防提供新的治療思路。

材 料 和 方 法

1主要試劑及儀器

聚甲基丙烯酸2-羧乙基酯(poly-2-hydroxyethyl methacrylate,poly-HEMA)、兔抗人caspase-3單克隆抗體購自Sigma。鼠抗人β-catenin、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)85、PI3K 110、Bcl-2和caspase-9單克隆抗體均購自Santa Cruz。鼠抗人caspase-8單克隆抗體購自Calbiochem。山羊抗小鼠IgG-HRP和山羊抗兔IgG-HRP為北京中山生物技術公司產品。逆轉錄聚合酶鏈反應試劑購自上海生物工程公司。細胞培養瓶和細胞培養液購自杭州四季青生物工程公司。FAC Scan 流式細胞儀為Becton Dickinson產品。垂直板電泳槽電轉移儀由Bio-Rad生產。電子顯微鏡為 Philps Tecnal 10型。

2細胞系

人骨肉瘤細胞MG63從武漢典藏中心購得，對照細胞系人成骨細胞hFOB 1.19，人腎上皮細胞293T細胞購自上海中科院細胞研究所，MG63細胞與293T細胞于DMEM培養液，hFOB 1.19細胞于1∶1 F12/DMEM+McCoy’s 5A(Invitrogen GibcoTM)培養液中培養，加上10%滅活的胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和1×105U/L鏈霉素，在5% CO2、37 ℃培養箱中培養。

3細胞懸浮培養皿的準備

將2 mL 50 g/L的poly-HEME無水乙醇溶液加入6孔板中,置室溫待其完全干燥,重復上述步驟1次,然后使用前用1×PBS緩沖液將6孔細胞培養板沖洗4遍,置于超凈臺中紫外線照射消毒待用。

4細胞的處理

將細胞用含0.01% EDTA的0.25%胰蛋白酶進行消化，制成約5×108cells/L的單細胞懸液，將2 mL接種于poly-HEMA處理過的6孔板中，同時取2 mL接種于普通的6孔板中作為陰性對照，將細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h、48 h、72 h及7 d。

5光學顯微鏡下觀測細胞形態

取實驗組和對照組細胞各5×105細胞，加入2 mL培養液置于光學顯微鏡下觀察細胞形態，以及細胞集落形成情況。

6電子顯微鏡觀測細胞形態及細胞結構

按常規電鏡樣品制備技術操作。固定，收集細胞，用體積分數為2%戊二醛固定過夜；后固定，離心棄固定液，PBS洗滌2次后，用質量濃度為1%鋨酸后固定1 h；預染，離心棄固定液，蒸餾水洗滌2次后，用質量濃度為2%醋酸鉛預染1 h；脫水，離心棄液預染，蒸餾水洗滌2次后，依次用體積分數35%、50%、75%、90%乙醇梯度脫水；環氧樹脂(Epon812)包埋；LKB超薄切片機切片；檸檬酸鉛染色；透色電鏡觀察并攝片(80 kV)。

7流式細胞儀檢測細胞凋亡率

取5×108cells/L細胞，70%冰乙醇固定，于4 ℃冰箱保存24 h，24 h 后PBS 洗2次，加入1 g/L RNase A 200 μL，37 ℃水浴30 min，再加PI 染色液避光反應30 min，上機檢測，將所得數據采用專用軟件CellQuest計算細胞凋亡比例。

8RT-PCR

5×108cells/L細胞加入1 mL Trizol 試劑，按照說明書操作提取總RNA，測定260和280 nm 處的吸光度，估計純度并定量RNA。RT：反應體積為20 μL；組成為：dNTPs 2 μL，5×逆轉錄buffer 4 μL，RNasin 20 U，Mo-AMV逆轉錄酶200 U，隨機六聚引物2 μg，總RNA 2 μg，去離子水加至20 μL。25 ℃ 10 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 10 min，停止反應。 PCR：反應體積為50 μL；組成為：10×PCR buffer 5 μL，Taq DNA酶2.5 U，逆轉錄產物2 μL，MgCl22 mmol/L，β-actin 正負鏈引物各0.2 μg，β-catenin和PI3K正負鏈引物各0.4 μg，去離子水加至50 μL。94 ℃預變性5 min，再94 ℃ 30 s,適當退火溫度1 min,72℃ 1 min,30個循環，72 ℃ 10 min 結束。用2%瓊脂糖凝膠電泳分離反應產物，溴化乙啶染色顯示，通過紫外成像系統對凝膠中各產物條帶吸光度進行積分，用細胞因子與β-actin PCR產物的吸光度絕對量比值對細胞因子的表達量進行相對定量。引物序列： 人β-catenin，正義引物 5’-GATTTGATGGAGTTGGACATGG-3’，反義引物 5’-TGTTCTTGAGTGAAGGACTGAG-3’；人PI3K,正義引物 5’-ATTGTGATACACCCTCCGTGGA-3’，反義引物 5’-TGATGAGGTATGCTAGGCGACC-3’；人GAPDH,正義引物 5’-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3’，反義引物 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

9蛋白免疫印跡(Westernblotting)分析相關蛋白的變化

收集細胞，溶于1 mL RIPA細胞裂解液中[50×10-3mol/L Tris-HCl(pH 7.4),150×10-3mol/L NaCl,1% NP40,5×10-3mol/L EDTA,5×10-3mol/L NaF,2×10-3mol/L Na3VO4,1×10-3mol/L PMSF,5 mg/L leupeptine,5 mg/L aprotinin]。Bradford法檢測蛋白濃度，將各組濃度調到同一水平，經12%SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉過夜，加入β-catenin、Bcl-2、PI3K 85 、PI3K 110、caspase-3、8、9單抗和β-actin(1∶1 000)，搖床上振搖2 h，PBST洗滌3次，每次10 min。再加入抗小鼠IgG-HRP，搖床上振搖2 h，PBST洗滌3次，ECL試劑顯色，干燥，顯影在柯達X光片上。在Leica Q500iw 圖像分析軟件上半定量分析條帶灰度值。

10統計學處理

結 果

1光鏡下細胞貼壁培養與懸浮培養的形態學表現

hFOB 1.19、293T、MG-63細胞貼壁狀態下生長良好，但hFOB 1.19、293T細胞在懸浮培養下細胞之間松散，幾乎不形成細胞聚集體，然而MG-63細胞相互之間聚集成比較大而緊密的聚集體，散在的細胞很少,見圖1。

Figure 1. Cell morphology of MG-63, 293T and hFOB 1.19 cells in poly-HEMA treated (in suspension condition) wells (×40 ) and poly-HEMA untreated (in adherent condition) wells (×100) under light microscope. The background of the suspended cell culture wells is poly-HEMA.

圖1光鏡下細胞貼壁培養與懸浮培養的形態學表現

2電鏡下細胞懸浮培養的形態學及細胞結構觀察

細胞懸浮培養72 h，電鏡下發現hFOB 1.19細胞以及293T細胞發生凋亡，形態學上表現凋亡的特性，但大部分MG-63細胞正常生長，細胞保持正常狀態。所有的細胞都建立起縫隙連接和橋粒等細胞間的連接,見圖2。

3細胞貼壁培養與懸浮培養的凋亡率

在懸浮狀態下培養，MG-63細胞的凋亡率明顯低于hFOB 1.19細胞和293T細胞的凋亡率。MG-63細胞在貼壁生長24 h后，其凋亡率為(3.17±0.75)%，懸浮狀態下培養24 h、48 h、72 h和7 d后，凋亡率分別為(6.27±2.88)%、(13.91±1.50)%、(20.33±1.62)%、(30.29±2.60)%，而hFOB 1.19細胞和293T細胞在懸浮狀態下生長7 d的凋亡率分別是(89.23±3.71)%、(95.88±1.32)%。 MG-63細胞具有抵抗失巢凋亡的能力,見圖3。

Figure 2. Cell morphology and cell junctions of MG-63, 293T and hFOB 1.19 cells in poly-HEMA treated wells under transmission electronic microscope.Cells were seeded on poly-HEMA untreated (in adherent condition) wells for 24 h and poly-HEMA treated (in suspension condition) wells for 72 h and were collected for TEM observation. Cells morphology were photographed(×3 700). Bar:5 μm. Cell junctions (suspended 72 h) were also photographed(×65 000). Bar:0.2 μm.

圖2電鏡下細胞懸浮培養的形態學及細胞結構觀察

圖3不同時間細胞貼壁生長與懸浮生長的凋亡率

4貼壁培養與懸浮培養對MG63骨肉瘤細胞PI3K和β-cateninmRNA和蛋白表達的影響

在懸浮培養24 h后，β-catenin 基因轉錄水平較貼壁狀態時減弱，但隨后β-catenin基因轉錄呈時間依賴性的增長，但β-catenin的蛋白表達在貼壁狀態和懸浮狀態下無顯著差異。在懸浮狀態下PI3K在24 h和48 h的轉錄水平比對照組高。PI3K蛋白有2個亞基，分別為P85 和 P110。其中無功能性的PI3K 85蛋白表達在72 h達到最高。PI3K 110蛋白表達對照組與實驗組無顯著差異,見圖4。

5貼壁培養與懸浮培養對MG63骨肉瘤細胞Bcl-2和caspase-3、8、9蛋白表達的影響

在懸浮狀態下培養24 h、48 h和72 h后，caspase-3和caspase-9蛋白無活化，與貼壁狀態下培養24 h無顯著差異。而在懸浮狀態下caspase-8在48 h時活化最多，Bcl-2的蛋白表達水平呈時間依賴性增長，在72 h達到最高,見圖5。

圖4貼壁培養條件與懸浮培養條件下MG63細胞PI3K和β-cateninmRNA和蛋白的表達

Figure 5. The translational level of caspase-3, caspase-8， caspase-9 and Bcl-2 in MG-63 cells seeded on poly-HEMA treated wells.1: MG-63 cell cultured in poly-HEMA untreated wells for 24 h. 2, 3, 4: MG-63 cell cultured in poly-HEMA treated wells for 24 h, 48 h and 72 h,respectively.n=3.

圖5貼壁培養與懸浮培養條件下MG63骨肉瘤細胞Bcl-2和caspase-3、8、9蛋白表達情況

討 論

很多類型細胞必須與胞外基質(ECM)黏附才能增殖，這種現象稱為錨定依賴，這些細胞一旦與基質分離，使外界輸入的存活信息中斷就引發失巢凋亡。本實驗發現，hFOB 1.19和293T細胞在細胞與細胞基質分離后，立即發生失巢凋亡，而MG-63細胞在懸浮狀態下培養7 d，最高的凋亡率為(30.29±2.60)%，表現出較強的抗凋亡特性，從而為骨肉瘤的遠處轉移和局部侵襲創造條件。

細胞同源性的黏附和細胞之間的信號轉導，對細胞的生物學性狀、生長、凋亡和分化有著重要的作用，同時對腫瘤細胞的侵襲性和轉移也有著重要的作用[4-7]。我們發現不同的細胞在懸浮狀態下形成不同的聚集體，MG-63細胞在懸浮狀態下相互之間形成了大而致密的聚集體，沒有發生明顯的細胞凋亡，而hFOB 1.19和293T細胞在懸浮培養下細胞之間松散，幾乎不形成細胞聚集體，發生明顯的anoikis，這可能MG-63細胞雖然失去與ECM的接觸，但仍會有細胞與細胞之間的連接，從而通過細胞與細胞之間信號轉導，模擬細胞與基質之間的信號轉導，從而使懸浮的細胞逃避anoikis[7-9]。

細胞與細胞之間的連接包括縫隙連接、橋粒等。縫隙連接存在于大部分組織和細胞間，橋粒通常只存在于上皮細胞，但我們電鏡觀察，hFOB 1.19和293T細胞和MG-63細胞在懸浮狀態下都形成了橋粒結構，這可能懸浮狀態下培養刺激細胞與細胞間連接的形成，但對細胞存活或凋亡的調控還依賴于不同存活或者凋亡信號的轉導。

β-catenin是細胞與細胞錨聯的重要信號分子，它可以通過信號轉導細胞增殖和轉化，激活PI3K，通過PI3K/Akt磷酸化而轉導細胞存活信號，從而抑制凋亡[7，10，11]，但我們發現雖然在懸浮狀態下β-catenin和PI3K的轉錄水平比對照組高，但蛋白表達水平對照組與實驗組無顯著差異，這可能存在某些分子抑制了β-catenin和PI3K的蛋白翻譯或者降解了β-catenin和PI3K蛋白。

Caspase是執行細胞凋亡的主要酶類，活化的caspase通過特異性的裂解底物而導致細胞的凋亡，通常caspase-8、9被認為是凋亡起始因子，caspase-3作為凋亡的執行因子[12]。呂海等[13]報道，人干擾素α2a可以通過調節細胞caspase信號途徑，誘導骨肉瘤細胞MG-63產生anoikis現象。有文獻報道[7，11，14，15]，當細胞與基質分離時，可以激活caspase-8，同時過度的表達Bcl-2可以抑制caspase-8的活化。我們實驗中，在懸浮狀態下，Bcl-2蛋白呈時間依賴性增長表達，caspase-8在起始48h就被活化，然后活性降低，但caspase-3活化水平始終無顯著改變，這可能在細胞懸浮早期細胞與基質分離或者其它一些通路激活了caspase-8，但高水平的Bcl-2表達以及可能一些其它分子表達，抑制了caspase-8的促凋亡能力，從而使促凋亡和抑凋亡達到了新的平衡，使MG63骨肉瘤細胞逃避anoikis。

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PossiblemechanismofanoikisresistanceinhumanosteosarcomaMG-63cells

LIN Ding-sheng, ZHANG Xiao-lei, JIANG Liang-fu, GAO Wei-yang

(DepartmentofOrthopaedicSurgery,SecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:linden2008@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the possible mechanism for the regulation of anchorage-independent survival by observing the resistance of human osteosarcoma cell line MG-63 to anoikis.METHODSHuman osteosarcoma cell line MG-63 was cultured in six-well plates under the conditions of pretreating with or without poly-2-hydroxyethyl methacrylate(poly-HEMA) for 24 h, 48 h, 72 h and 7 days. Human fetal osteoblasts cell hFOB 1.19 and human kidney epithelial cell 293T were used as controls. Morphological changes of the cells treated with ploy-HEMA were observed under microscope by aggregation assay. The cell junctions were evaluated under transmission electronic microscope. Apoptosis rate in response to anoikis was determined by flow cytometry. The transcriptional levels of β-catenin and phosphoinositide 3-kinase(PI3K) were analyzed by RT-PCR. The protein levels of β-catenin, PI3K, Bcl-2 and activation of caspase-3, 8, 9 were examined by Western blotting.RESULTSHuman kidney epithelial cell 293T and human osteoblast cell hFOB1.19 significantly underwent anoikis when adherence was denied. Human osteosarcoma MG-63 cells were distinctly anoikis-resistant when detached. Caspase-8 in suspension cultured MG-63 cells was activated by cell-matrix detachment. Translational level of Bcl-2 significantly increased in a time-dependent manner.CONCLUSIONThe MG-63 cells show resistance to anoikis when detachment of adherent cells from extracellular matrix occurs. Over-expression of Bcl-2 participates in the process of anoikis by blocking the activation of caspase-8, resulting in the resistance of MG-63 cells to anoikis.

Anoikis; Osteosarcoma; Protein Bcl-2; Caspase-8

R73-3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.032

1000-4718(2011)01-0165-06

2010-07-08

2010-11-08

浙江省自然科學基金資助項目(No. Y2100897);溫州市科技計劃資助項目(No.Y20100233)

△ 通訊作者Tel 0577-88879012； E-mail： linden2008@yahoo.com.cn