奧美沙坦酯對慢性心力衰竭小鼠腎臟損傷的保護作用*

盧曉梅， 金玉楠， 于艷秋， 張海鵬

(中國醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室，遼寧 沈陽 110001)

奧美沙坦酯對慢性心力衰竭小鼠腎臟損傷的保護作用*

盧曉梅， 金玉楠， 于艷秋△， 張海鵬

(中國醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室，遼寧 沈陽 110001)

目的探討奧美沙坦酯對慢性心力衰竭小鼠腎臟損傷的影響。方法健康C57小鼠分為假手術組(sham組)、慢性心力衰竭組(CHF組)和奧美沙坦酯治療組(OLM+CHF組)。以冠狀動脈左前降支結扎法建立慢性心力衰竭小鼠模型，其中奧美沙坦酯治療組以10 mg/kg劑量每天胃飼。12周時觀察各組小鼠心率、血壓、心功能狀況、血肌酐、血尿素氮、血漿和腎臟血管緊張素Ⅱ水平；real-time PCR法檢測腎臟腎素、血管緊張素1型受體(AT1R)和血管緊張素原(AGT)的表達情況，PAS染色觀察腎組織結構變化。結果與shan組相比，CHF組和OLM+CHF組左室舒張末期內徑(LVDd)和左室收縮末期內徑(LVDs)顯著增加(P<0.05),短軸縮短率(FS)和射血分數(EF)顯著降低(P<0.05)。與sham組相比，CHF組收縮壓、血肌酐和血尿素氮含量顯著增高，OLM+CHF組以上指標較CHF組均顯著降低(P<0.05)。與sham組相比，CHF組血漿和腎臟血管緊張素Ⅱ水平增高，腎素、AT1R和AGT表達增高(P<0.05)，OLM+CHF組腎臟血管緊張素Ⅱ水平、腎素、AT1R和AGT表達較CHF組均顯著降低(P<0.05)。CHF組PAS染色可見腎小球系膜區擴張，腎小管間質PAS陽性染色物明顯增多。OLM+CHF組腎小球系膜區和腎小管間質PAS染色陽性物質與CHF組相比明顯減少。結論慢性心力衰竭可使腎內腎素血管緊張素系統激活并導致腎臟損傷，奧美沙坦酯通過抑制血管緊張素Ⅱ起到腎臟保護作用。

奧美沙坦酯； 慢性心力衰竭； 腎損傷

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)病人出現腎功能不全即心腎綜合征的問題，逐漸引起人們的注意[1]。廣義的心腎綜合征是指心臟和腎臟中的一個器官對另一個器官的共同損害。狹義的心腎綜合征特指慢性心力衰竭引起進行性腎臟損害并導致腎功能不全，通常認為是慢性心力衰竭終末期的表現[2]。近年來，隨著老齡化社會的逐步形成和人民生活水平的提高，慢性心血管病的發病率明顯升高，內外科治療的進展使許多病人在疾病的急性期得到了有效的治療，病情發展到終末期的病人也明顯增加，因而常存在腎功能不全，出現心腎綜合征表現。心腎綜合征的發病機制比較復雜，研究發現腎素血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)過度激活是一個重要的發病因素[3]，RAS系統激活的產物血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)可以通過血流動力學效應和非血流動力學效應參與腎臟的損傷，其非血流動力學效應如促進氧化應激，導致細胞外基質沉積等作用主要是由臟器局部產生的Ang Ⅱ介導的[4]。體內外研究表明，奧美沙坦酯(olmesartan medoxomil, OLM)可以阻斷任何來源的Ang Ⅱ所致的相應生理作用[5]。因而本研究應用冠狀動脈左前降支結扎術建立CHF模型，并給予奧美沙坦酯干預，觀察CHF小鼠腎臟RAS系統激活情況以及奧美沙坦酯對腎臟損傷的保護作用。

材 料 和 方 法

1主要試劑和儀器

奧美沙坦酯購于上海三共制藥有限公司；Ang Ⅱ放免試劑盒購自北京北方生物技術研究所；RNA提取試劑盒;cDNA合成試劑盒購自大連寶日醫生物技術有限公司；real-time PCR反應試劑盒購自Applied Biosystems；引物序列合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成；全自動生化分析儀由日立生產。

2動物模型的建立及分組

12周齡成年雄性C57小鼠36只，體重(25±3)g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。動物隨機分為3組：假手術組(sham組，n=11)；慢性心力衰竭組(CHF組，n=14)和奧美沙坦酯治療組(OLM+CHF組，n=11)。各組小鼠按50 mg/kg腹腔注射苯巴比妥鈉麻醉，人工呼吸機輔助呼吸。迅速打開左前胸并暴露心臟。用7/0尼龍絲線在左心耳下方2 mm處結扎冠狀動脈左前降支，顯微鏡下確認，將心臟復位后擠壓出胸腔內氣體并迅速縫合關閉胸腔。Sham組穿線而不結扎動脈，余步驟同CHF、OLM+CHF組。Sham組、CHF組每天給予正常飼料和飲水，OLM+CHF組術后給予正常飼料和飲水的同時開始給予奧美沙坦酯10 mg·kg-1·d-1灌胃。3組小鼠術后12周檢測各項指標。

3心率、血壓的測定和心臟超聲檢查

動物處死前1 d，使用智能無創血壓計進行清醒狀態下小鼠尾動脈間接測壓，分別測定各組收縮壓(systolic blood pressure, SBP) 和心率(heart rate, HR)，每只動物連續測5次計算平均值。術前及術后12周應用美國惠普HP5500超聲儀及15 MHz高頻探頭行經胸心臟超聲檢查。小鼠半量麻醉，保持自主呼吸，于胸骨旁乳頭肌水平短軸切面采集左心室二維圖像及主動脈血流情況。同時獲得二維引導下10個心動周期的M型超聲心動圖記錄。測量室間隔厚度(interventricular septal thickness，IVS)、左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVDd)、左室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic dimension，LVDs)、短軸縮短率(fractional shortening，FS)和射血分數(ejection fraction，EF)。

4血肌酐、血尿素氮、血漿和腎臟血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)水平測定

實驗結束小鼠腹腔麻醉后心臟取血，一部分離心分離血清，酶法測定小鼠尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血肌酐(serum creatinine,Scr)濃度。一部分制備血漿保存備用；另取50 mg腎臟標本，在冰浴中勻漿，勻漿液中加入酶抑制劑后離心取上清液，血漿和腎組織勻漿按照Ang Ⅱ放免試劑盒說明檢測AngⅡ含量。

5Real-timePCR法檢測腎素、AT1R和血管緊張素原表達

取各組腎臟組織，按照試劑盒要求提取總RNA，并將RNA反轉錄成cDNA, 設計相應的引物(引物序列見表1)，應用SYBR green PCR master mix，在ABI Prism 7900T 序列檢測系統檢測分析，反應條件為20 μL反應體系，按94 ℃ 30 s，然后94 ℃ 5 s， 55 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s 擴增40個循環，分析溶解曲線，計算各個樣本的相對濃度。

表1 腎素、AT1R、AGT和GAPDH PCR 引物序列

AT1R:angiotensin type 1 receptor; AGT:angiotensinogen.

6PAS染色檢測腎組織病理學改變

實驗完成后取腎組織，吸干表面水分并立即置于福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，切成3 μm切片，PAS染色后光鏡下觀察腎小球、腎間質和腎血管的結構改變。

7統計學處理

結 果

1死亡率及心功能評價

Sham組術后12周均存活且一般情況佳；CHF組死亡3只，死亡率為21.4%(3/14)，死因為嚴重的心力衰竭，其余小鼠均不同程度出現呼吸急促、喘鳴、進食和活動減少等情況；OLM+CHF組小鼠也有輕微的進食、活動減少等情況出現。CHF和OLM+CHF組小鼠解剖可見左室腔擴大，肝臟和肺臟淤血腫大，有胸腔積液和腹腔積液。與sham組比較，CHF和OLM+CHF組LVDd和LVDs顯著增加(P<0.05)，EF和FS顯著降低(P<0.05)。與sham組相比，CHF組收縮壓顯著增高(P<0.05)，OLM+CHF組較CHF組顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠心率、血壓及心臟超聲指標

#P<0.05vssham group；*P<0.05vsCHF group．

2血肌酐、血尿素氮、血漿和腎臟血管緊張素Ⅱ水平

與sham組相比，CHF組小鼠BUN和Scr明顯升高，OLM+CHF組小鼠BUN和Scr水平較CHF組有顯著改善(P<0．05)。與sham組相比，CHF組血漿和腎臟血管緊張素Ⅱ水平增高，OLM+CHF組較CHF組腎臟血管緊張素Ⅱ水平顯著降低，血漿水平顯著增高(P<0.05),見表3。

表3血清肌酐、尿素氮、血漿和腎臟血管緊張素Ⅱ水平測定

GroupBUN(mmol/L)Scr(μmol/L)PlasmaangiotensinⅡ(pmol/L)KidneyangiotensinⅡ(fmol/g)Sham6.6±0.946.3±7.861.3±22.128.4±13.9CHF24.9±5.4#92.0±12.7#93.2±18.2#169.3±19.8#OLM+CHF19.7±4.2*69.6±4.3*214.6±38.6*98.8±10.5*

#P<0.05vssham group；*P<0.05vsCHF group．

3PAS染色病理學觀察結果

PAS染色見正常小鼠腎小球及腎小管結構清晰，腎小管上皮細胞排列整齊，基底膜完整，間質中未見炎癥細胞浸潤。CHF組可見腎小球系膜區擴張，腎小管管腔擴張，基底膜不規則增厚，腎小管間質PAS染色陽性物明顯增多。OLM+CHF組小鼠腎臟病變均有不同程度改善，腎小球系膜區和腎小管間質PAS染色陽性物質明顯減少,見圖1。

圖1各組PAS染色結果

4腎素、AT1R和AGT表達結果

與sham組相比，CHF組腎素、AT1R和AGT表達增高(P<0.05)，OLM+CHF組腎素、AT1R和AGT表達較CHF組均顯著降低(P<0.05),見表4。

表4不同組別腎臟組織中renin、AT1R和AGTmRNA表達

GroupReninAT1RAGTSham0.20±0.021.55±0.071.00±0.10CHF1.11±0.07#2.11±0.10#1.47±0.07#OLM+CHF0.46±0.07*1.74±0.07*1.33±0.09*

#P<0.05vssham group；*P<0.05vsCHF group.

討 論

在心功能不全時，腎臟血流灌注減少和RAS活化等因素可導致腎功能的進行性下降[6]。傳統認為腎素-血管緊張素系統在全身起著重要的作用，如調節醛固酮的釋放，調節體液平衡等[7]。然而近年來發現組織局部RAS系統激活可介導AngⅡ有關細胞生長、心肌及血管增生肥厚、心室及血管重構、腎臟纖維化等長期效應[8]。研究發現，腎臟局部RAS過度激活與許多腎臟疾病包括腎病和腎動脈硬化等有關。 RAS過度激活的主要效應包括氧自由基的生成、 NF-κB的激活以及纖維母細胞增殖、炎癥、細胞外基質過度沉積等[9]。RAS過度激活后產生的AngⅡ可作用于腎小球系膜細胞和足細胞，導致腎小球硬化和腎功能損害[10]。我們的研究結果表明，模型組LVDd和LVDs顯著增加，FS和EF顯著降低，表示心功能顯著降低，而PAS 染色結果和血肌酐和血尿素氮含量增高說明模型組出現了腎小球硬化和腎功能不全表現，同時體內RAS系統激活，血漿和腎臟血管緊張素Ⅱ水平增高，腎臟腎素、AT1R和AGT表達增高，與以往研究結果相吻合。

AngⅡ受體有4種亞型，但其生理效應多由AT1R介導。研究顯示AT1R 廣泛分布于腎組織的各種細胞， AT1R在AngⅡ作用下可導致腎血管收縮，腎血流量下降及腎小球內壓力增加；刺激系膜細胞外基質產生并抑制其降解；刺激纖溶酶原激活物抑制劑-1及其它一些生長因子的產生[11]。 而AT2R 主要分布于腎小球入球小動脈和系膜細胞等處，可使入球小動脈擴張，并可抑制系膜細胞生長并刺激其凋亡，同時AT2R在腎臟能刺激產生NO，所以這2種受體的生理作用幾乎是相互拮抗的[12]。 我們研究應用的奧美沙坦酯是一種前體藥物，經胃腸道吸收水解為奧美沙坦。奧美沙坦為選擇性AT1R拮抗劑，通過選擇性阻斷血管緊張素Ⅱ與AT1R結合而阻斷血管緊張素Ⅱ的作用。我們的結果顯示治療組腎功能損傷相對減輕，可見奧美沙坦酯通過與AT1R的結合抑制了腎內RAS系統的過度激活，從而阻斷了血管緊張素Ⅱ對腎臟的損傷作用，我們還發現OLM組血漿血管緊張素Ⅱ顯著增高，循環中增高的血管緊張素Ⅱ可能會與AT2R結合，從而發揮保護作用。

綜上所述，慢性心力衰竭可使腎內腎素血管緊張素系統激活，并導致腎小球硬化和腎臟損傷，奧美沙坦酯通過抑制血管緊張素Ⅱ起到腎臟保護作用。

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Protectiveeffectofolmesartanmedoxomilonrenalinjuryinmicewithchronicheartfailure

LU Xiao-mei, JIN Yu-nan, YU Yan-qiu, ZHANG Hai-peng

(DepartmentofPathophysiology,CollegeofBasicMedicalSciences,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail:yqyu@mail.cmu.edu.cn)

AIM: To investigate the protective effect of olmesartan medoxomil on renal injury in mice with chronic heart failure (CHF).METHODSC57 mice were divided into sham operation group (sham group), chronic heart failure group (CHF group) and olmesartan medoxomil treatment group (OLM+CHF group). The experimental CHF model was established by ligation of left anterior descending branch of coronary artery. The mice in OLM+CHF group were fed with olmesartan medoxomil daily at the dose of 10 mg/kg. After 12 weeks, the heart rate, blood pressure, cardiac functions, serum creatinine and blood urea nitrogen levels, the angiotensin Ⅱ levels in plasma and renal tissues were measured. The expression levels of renal rennin, angiotensin type 1 receptor(AT1R) and angiotensinogen (AGT) were determined by real-time PCR. The pathological changes of the kidneys were observed under microscope with PAS staining.RESULTSCompared with sham group, left ventricular end-diastolic dimension(LVDd) and left ventricular end-systolic dimension(LVDs) were significantly increased (P<0.05), while fractional shortening(FS) and ejection fraction(EF) were significantly decreased in the mice of CHF and OLM+CHF groups (P<0.05). Compared with sham group, systolic blood pressure, the levels of serum creatinine and blood urea nitrogen, and the PAS staining positive area of the kidneys were significantly increased in CHF group (P<0.05), while in OLM+CHF group these changes were significantly lower than those in CHF group (P<0.05). Compared with sham group, the levels of angiotensin Ⅱ in plasma and kidney, the expression of renin, AT1R and AGT were increased in CHF group (P<0.05). In OLM+CHF group, the angiotensin Ⅱ level in the kidneys and the expression of renin, AT1R and AGT were significantly lower than those in CHF group (P<0.05).CONCLUSIONChronic heart failure activates the intrarenal renin-angiotensin system, leading to glomerular sclerosis and renal injury. Olmesartan medoxomil protects kidneys by inhibiting the effects of angiotensin Ⅱ.

Olmesartan medoxomil; Chronic heart failure; Renal injury

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.028

1000-4718(2011)01-0145-04

2010-05-19

2010-11-02

遼寧省教育廳高等學?？蒲匈Y助項目(No. 20060946)；遼寧省科技廳藥物源頭創新研究資助項目(No. 2006226031-211)

△通訊作者 Tel：024-23256666-5362； E-mail: yqyu@mail.cmu.edu.cn