六味地黃丸含藥血清對HK-2細胞TGF-β/Smad信號通路的影響*

郝艷鵬, 張 悅△, 劉煜敏, 陸 敏, 王 飛, 陸海英

(上海中醫(yī)藥大學1科技實驗中心，2護理學院，上海 201203)

六味地黃丸含藥血清對HK-2細胞TGF-β/Smad信號通路的影響*

郝艷鵬1, 張 悅1△, 劉煜敏1, 陸 敏1, 王 飛1, 陸海英2

(上海中醫(yī)藥大學1科技實驗中心，2護理學院，上海 201203)

目的觀察六味地黃丸含藥血清對HK-2細胞增殖及其Smad通路信號影響。方法MTT法檢測大鼠5%、10%、20%空白血清與5%、10%、20%含藥血清對HK-2細胞增殖的影響，并采用蛋白印跡法檢測10%含藥血清對HK-2細胞Smad通路信號分子蛋白表達的影響。結果六味地黃丸含藥血清可以促進HK-2細胞增殖；在HK-2細胞中，TGF-β1可明顯促進Smad2蛋白的磷酸化，而10%六味地黃丸含藥血清具有明顯的抑制效應。10%六味地黃丸含藥血清亦可促進SnoN蛋白表達，明顯高于對照組和空白大鼠血清組。結論六味地黃丸含藥血清能夠抑制TGF-β1誘導的HK-2細胞Smad2蛋白的磷酸化，促進TGF-β/Smad通路的負性調控因子SnoN蛋白的表達。

六味地黃丸； 腎小管上皮細胞； 信號轉導； 蛋白表達

轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是公認的促纖維化細胞因子之一。在病理條件下，TGF-β通過其受體介導的Smads信號轉導通路調節(jié)靶基因的表達，從而促進纖維化的發(fā)生和發(fā)展。因此，限制和逆向調控TGF-β/Smad信號的轉導是治療腎纖維化的關鍵。有研究表明傳統(tǒng)中醫(yī)藥可以通過調控TGF-β/Smad信號的轉導而發(fā)揮防治腎纖維化的作用[1],而且,六味地黃丸可延緩腎組織的纖維化[6]。本研究進一步觀察六味地黃丸含藥血清對腎小管上皮細胞的TGF-β/Smad信號通路是否有逆向調控的作用？

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 健康雄性Wistar大鼠(180 g±20 g)20只，清潔級，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,合格證號為SCK(滬)2008-0016，上海中醫(yī)藥大學醫(yī)學實驗動物中心按照SPF級飼養(yǎng)。

1.2藥物 六味地黃丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司，批號8074423)，取六味地黃丸200丸(每8丸相當于生藥材量3 g)加蒸餾水約100 mL，攪拌，使之完全溶解后，濃縮其藥液至0.78 kg/L。

1.3主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，0.25%胰酶(Gibco)，青/鏈霉素注射液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(Pierce )，RIPA裂解液(北京普利萊基因技術有限公司)，MTT(Amresco)，rhTGF-β1(Peprotech Inc.)，DMSO(國藥集團化學試劑有限公司)，小鼠單抗Smad2(Cell Signaling)，兔抗大鼠p-Smad2多克隆抗體(Cell Signaling)，SnoN抗體(Santa Cruz)，小鼠抗大鼠Smad7單克隆抗體(R&D)，小鼠單抗GAPDH(上海康成生物工程公司)。

1.4主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(SHEL LAB)，低溫冷凍離心機(Sigma)，超凈工作臺(上海迅博實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)，倒置顯微鏡(Olympus)，電泳儀(Bio-Rad)，全自動酶標儀(Biotek)，25 cm2塑料培養(yǎng)瓶(Corning)，塑料培養(yǎng)板(Corning，6孔、12孔、96孔)，微孔濾膜(上海市新亞凈化器件廠)。

2方法

2.1含藥血清的制備 大鼠按體重隨機分為空白對照組(10只)和給藥組(10只)，給藥組以生藥濃度為0.78 kg/L六味地黃丸水溶液，按10 mL水溶液/kg BW灌胃，每天2次，空白組給予同體積生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥3 d，第4 d頭次給藥1 h后腹主動脈取血，4 ℃冷置過夜后3 000 r/min 離心15 min 分離血清， 56 ℃水浴30 min 滅活補體，超濾滅菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2HK-2細胞的培養(yǎng) 人近端腎小管上皮細胞株HK-2，以含10%胎牛血清的DMEM/DF12培養(yǎng)液，5% CO2、 37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)。

2.3MTT法檢測不同濃度含藥血清對HK-2細胞增殖的影響 取生長至80%的細胞，制成5×107cells/L的細胞懸液每孔200 μL轉種入96孔板中，細胞貼壁生長至60%左右時，用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基同步化24 h，將細胞分為5%、10%、20%正常大鼠血清(NS)組、5%、10%、20%含藥血清(MS)組以及空白對照組，每組設5個復孔，培養(yǎng)48 h后每孔加入20 μL 5 g/L MTT，37 ℃恒溫培養(yǎng)4 h，吸出上清液，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩器振蕩10 min，用酶標儀測490 nm 波長處每孔的吸光度值。

2.4細胞蛋白的提取 取生長至80%的細胞，制成5×107cells/L的細胞懸液，每孔1 mL轉種入12孔板中，細胞貼壁生長至60%左右時，用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基同步化24 h后分組刺激。分組如下：正常組(Ctrl)、10%正常大鼠血清組(NS)、10%含藥血清組(MS)、TGF-β1組(T)、10%正常大鼠血清+ TGF-β1組(NS+T)、10%含藥血清+TGF-β1組(MS+T)進行實驗。正常組用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，NS、MS組分別用10% 正常血清和含藥血清培養(yǎng)24 h，含TGF-β1組以終濃度為5 μg/L TGF-β1刺激30 min后收獲細胞，棄去培養(yǎng)基，用預冷D-Hanks液洗滌12孔板細胞3次，每孔加入100 μL預冷的RIPA裂解液，反復吹打各孔細胞10 min，收集全部液體入EP管中。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，轉移上清液至另一預冷的1.5 mL EP管中。取少量上清按照BCA蛋白定量試劑盒說明書的操作步驟進行定量，用上樣緩沖液將所有蛋白調至等濃度，充分混合后于100 ℃煮沸變性10 min，冰浴10 min后上樣20 μL。

2.5Western blotting法檢測HK-2細胞TGF-β/Smad通路信號分子蛋白的表達 蛋白變性后在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳中以上層膠80 V、下層膠150 V分離，然后采用濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉1 h后，加入Ⅰ抗4 ℃ 搖床過夜，第2 d 回收Ⅰ抗，TTBS緩沖液洗3次，每次10 min，再加入相應辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，室溫搖床孵育2 h，最后用ECL化學發(fā)光法在X線膠片上顯影，并掃描結果條帶，測定吸光度值(absorbance,A)。

中3統(tǒng)計學處理

結 果

1MTT法檢測不同濃度含藥血清對HK-2細胞增殖的影響

由表1可見，與空白對照組比較，5%六味地黃丸含藥血清組，10%、20%正常血清和六味地黃丸含藥血清組A值明顯增加(P<0.05)；說明都能促進細胞增殖；相同濃度情況下，大鼠10%、20%正常血清和六味地黃丸含藥血清組A值比較無顯著差異(P>0.05)；而5%六味地黃丸含藥血清A值明顯高于5%正常大鼠血清組(P<0.05)。

表1MTT法測定的各組HK-2細胞A值

GroupAvalueNormalserumDrug-containingserumControl0.64±0.170.64±0.175%0.68±0.160.82±0.12*#10%0.76±0.12*0.83±0.15*20%0.88±0.19*0.83±0.14*

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsnormal serum.

2Westernblotting結果

2.1Smad2蛋白表達及其磷酸化水平 各組間Smad2蛋白表達未見明顯差異，而TGF-β1刺激組Smad2蛋白磷酸化水平明顯升高(P<0.05)；與TGF-β1刺激組比較，NS+T組Smad2蛋白磷酸化水平無明顯改變，而MS+T組Smad2蛋白磷酸化水平明顯降低(P<0.05)，見圖1。

圖1各組HK-2細胞中Smad2蛋白表達及其磷酸化水平的比較

2.2SnoN、Smad7蛋白的表達 MS組、MS+T組均可見SnoN蛋白表達明顯增加(P<0.05)，正常大鼠血清組未見此作用；而各組間Smad7蛋白表達未見明顯差異，見圖2。

圖2各組HK-2細胞中Smad7、SnoN蛋白表達的比較

討 論

腎小管上皮細胞轉分化(tubular epithelial to menchymal transdifferentiation，EMT) 是腎小管間質纖維化發(fā)生和發(fā)展的重要病理機制之一。EMT受多種細胞因子、生長因子和激素的調節(jié)，其中TGF-β是最重要的促纖維化因子,在病理條件下可觸發(fā)和完成EMT的全過程。Smads信號轉導是TGF-β1誘導EMT的關鍵通路。國外文獻報道TGF-β1以劑量和時間依賴的方式誘導Smad2的磷酸化和向核內轉位[2]。核轉錄共抑制因子SnoN是TGF-β/Smad信號通路中的重要負性調控因子，能夠與活化的Smad2相互作用，有效阻斷Smad依賴的啟動子的核轉錄活性，起到阻斷TGF-β1誘導的EMT的作用[3]。

六味地黃丸為滋陰補腎的經典名方，出于宋·錢乙《小兒藥證直決》，錢氏從《金匱》腎氣丸減桂、附脫胎而成，為后世補劑之主方。方中熟地滋陰補腎、生血生精為君藥；澤瀉滲泄?jié)駶幔簧捷侨鉁仞B(yǎng)肝腎；丹皮性寒清熱兼能祛瘀活血；山藥健脾益腎，茯苓淡滲脾濕、清氣分之熱。本方用熟地、山萸肉、山藥三味補益肝脾腎，用澤瀉、丹皮、茯苓以泄?jié)崆鍩釢B濕，此方歷來認為“補中有瀉，寓瀉于補，為通補開合之劑”，有熟地之滋補腎水即有澤瀉宜泄腎濁以濟之；有萸肉之溫澀吁經即有丹皮之清瀉肝火以佐之；有山藥之收攝脾經即有茯苓之淡滲脾濕以和之，故一直認為六味地黃丸為“三補三瀉”之劑，滋陰補腎之主方。六味地黃丸在治療腎臟疾病方面有較為廣泛的應用。現代研究表明[4，5]，六味地黃湯可增強機體的抗氧化能力，加速自由基及其代謝產物的消除，減輕體內的脂質過氧化反應，促進蛋白質的合成，加強受損組織的修復。李萬斌等[6]研究發(fā)現六味地黃丸能夠減輕5/6 腎切除大鼠殘腎組織纖維化程度，而升高MMP-2活性，進而減少膠原的沉積，可能是六味地黃丸治療慢性腎臟病的機制之一。六味地黃膠囊和六味地黃湯加味治療性給藥，均能改善阿霉素腎病綜合征病鼠氮質血癥、低蛋白血癥和高脂血癥，增強其抗氧化能力，加速自由基及其代謝產物的消除，減輕體內的脂質過氧化反應，以及改善病鼠腎組織病理學改變等[7]。另外六味地黃丸還可以抑制大鼠衰老基因的表達，起到延緩衰老的作用[8]。

本實驗中用TGF-β15 μg/L作用于HK-2細胞30 min，誘導了Smad通路的激活，p-Smad2蛋白的含量比正常對照組明顯增加，而給予六味地黃丸含藥血清孵育24 h后p-Smad2蛋白的含量比模型組明顯降低，可見六味地黃丸含藥血清能夠明顯抑制TGF-β1的作用；而且六味地黃丸含藥血清能明顯促進HK-2細胞SnoN的蛋白表達，核轉錄共抑制因子SnoN是TGF-β/Smad信號通路中的重要負性調控因子，它可通過與Smad蛋白相互作用，來抑制TGF-β1靶基因的活化，從而調控TGF-β1的生物效應。因此，我們結合體內實驗結果[9]，認為六味地黃丸對腎小管保護作用的部分機理為抑制Smad通路的激活以及促進該通路負性調控因子SnoN蛋白的表達。

[1] 劉煜敏，張 悅，何立群，等. 抗纖靈方對單側輸尿管梗阻大鼠TGF-β1-Smad通路的影響[J].中國病理生理雜志，2008，24(12)：2423-2427.

[2] Lan HY. Tubular epithelial-myofibroblast transdiferentiation mechanisms in proximal tubule cells[J]. Curr Opin Nephml Hypertens, 2003,12(1):25-29.

[3] Yang JW, Dai CS, Liu YH. A novel mechanism by which hepatocyte growth factor blocks tubular epithelial to mesenchymal transition[J]. J Am Soc Nephrol,2005,16(1):68-78.

[4] 湯依群，何小健，黃 寶，等.六味地黃丸抗氧化作用研究[J].中藥藥理與臨床，2001，17(5)：2-3.

[5] 許友慧，陳明達，王長江.六味地黃丸治療腎臟疾病的實驗研究進展[J].河北中醫(yī)，2009，31(6)：946-948.

[6] 李萬斌，何澤云．六味地黃丸延緩5/6腎切除大鼠腎組織纖維化研究[J].中國藥師，2009，12(4)：411-413.

[7] 林潔茹，潘競鏘，肖柳英，等．六味地黃膠囊及六味地黃湯加味對阿霉素性大鼠腎病綜合征作用的實驗研究[J].中醫(yī)研究，2005，18(3)：17-19.

[8] 余榕捷，蒲含林，周天鴻，等.利用基因芯片研究六味地黃丸對老年大鼠基因表達的影響[J].中國病理生理雜志，2004，20 (2):260-265.

[9] 郝艷鵬，張 悅，劉煜敏，等. 六味地黃丸對慶大霉素腎中毒大鼠腎核因子κB的影響[J]. 中藥材，2010，33(1)：86-89.

Effectofdrug-containingserumofLiuweiDihuangpillsonTGF-β/SmadsignalingpathwayinHK-2cells

HAO Yan-peng1, ZHANG Yue1, LIU Yu-min1, LU Min1, WANG Fei1, LU Hai-ying2

(1ExperimentCenterforScienceandTechnology,2CollegeofNursing,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China.E-mail:yuezhang_shanghai@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the effect of the drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills on the TGF-β1/Smad signaling pathway in HK-2 cells.METHODSThe proliferation of HK-2 cell was detected by MTT method. Western blotting analysis was used to investigate the effect of the drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills on the protein expression of the molecules of Smad signal transduction pathway.RESULTSThe drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills promoted the proliferation of HK-2 cells. The level of Smad2 phosphorylation in HK-2 cells treated with 10% drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills was significantly lower than that in the cells treated with TGF-β1. Furthermore, SnoN, a negative factor in Smad signaling pathway, was up-regulated in HK-2 cells treated with 10% drug-containing serum.CONCLUSIONDrug-containing serum of Liuwei Dihuang pills inhibits TGF-β1/Smad signaling pathway, including reducing Smad2 phosphorylation and promoting SnoN protein expression.

Liuwei Dihuang pills; Renal tubular epithelial cells; Signal transduction; Protein expression

R285

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.029

1000-4718(2011)01-0149-04

2010-07-16

2010-10-06

國家自然科學基金資助項目(No.30371834);上海市教育委員會重點學科建設項目(第5期,No.J50301);上海高校創(chuàng)新團隊建設項目

△通訊作者 Tel:021-51322391; E-mail: yuezhang_shanghai@yahoo.com.cn