槲皮素抑制魚藤酮誘導的PC12細胞凋亡*

畢 偉， 朱麗紅， 王傳明， 梁嫣然， 陶恩祥△

(1中山大學孫逸仙紀念醫院神經科，廣東 廣州 510120；2暨南大學醫學院病理生理學系，廣東 廣州 510632)

槲皮素抑制魚藤酮誘導的PC12細胞凋亡*

畢 偉1▲， 朱麗紅2▲， 王傳明1， 梁嫣然1， 陶恩祥1△

(1中山大學孫逸仙紀念醫院神經科，廣東 廣州 510120；2暨南大學醫學院病理生理學系，廣東 廣州 510632)

目的探討槲皮素對魚藤酮誘導的PC12細胞凋亡的影響及其作用機制。方法運用魚藤酮誘導損傷PC12細胞，經300 μmol/L槲皮素預處理后，觀察細胞形態學改變，流式細胞術檢測細胞凋亡率，Western blotting檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達，JC-1染色檢測細胞線粒體膜電位,比較各組的差異。結果與魚藤酮組相比，槲皮素加魚藤酮處理組細胞形態明顯改善，凋亡率降至6.3%(P<0.01)，Bcl-2表達增加(P<0.01)，Bax表達降低(P<0.01)，線粒體膜電位上升(P<0.01)。結論槲皮素對魚藤酮誘導的PC12細胞凋亡具有抑制作用，上調Bcl-2和下調Bax蛋白的表達，維持線粒體膜電位可能是其作用的機制之一。

槲皮素； 魚藤酮； 細胞凋亡； PC12細胞； 帕金森病

帕金森病(Parkinson disease，PD)是中老年最常見的神經系統變性疾病之一，在60歲以上人群中患病率高達1%，PD病理上表現為黑質多巴胺神經元變性、丟失，膠質增生，胞漿內出現特征性嗜酸性包涵體即路易體(Lewy body，LB)[1]。大量研究顯示，雌激素在維持黑質紋狀體DA系統的功能完整中發揮重要作用[2,3]。但是雌激素有增加女性患子宮內膜癌和乳腺癌的風險，因而限制了它的臨床應用。槲皮素與己烯雌酚相似而具有雌性激素樣作用，是植物類雌激素，且不會增加女性患子宮內膜癌和乳腺癌的風險[4,5]。那么該藥能否代替雌激素對PD黑質神經元發揮保護作用尚缺乏研究。本研究采用魚藤酮誘導PC12細胞凋亡模型，觀察槲皮素對神經元凋亡的抑制作用，以及槲皮素抑制凋亡的可能細胞內分子機制。

材 料 和 方 法

1材料

大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞((已經由神經生長因子誘導分化)購自中國科學院細胞庫。細胞培養基DMEM-F12為Hyclone產品，胎牛血清為TBD產品。槲皮素(純度﹥98%)、魚藤酮、胰酶、MTT、碘化丙啶(propidium iodide,PI)及核染料4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(Dapi)為Sigma產品。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒為Beckman Coulter產品。B 細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)、Bcl-2 相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)Ⅰ 抗為Cell Signaling Technology產品。5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzim-idazolylcarbocyanine iodide (JC-1) 檢測試劑盒為Molecular Probe產品。熒光倒置顯微鏡為Olympus產品，FACSCalibur流式細胞儀為Becton Dickinson產品。

2方法

2.1PC12細胞培養方法 大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養液中，置37 ℃、5%CO2培養箱內培養，取對數生長期細胞進行實驗。

2.2實驗分組和給藥方法 設立4個組：空白對照組：魚藤酮組(1.6 μmol/L)、單純槲皮素處理組(300 μmol/L)、槲皮素加魚藤酮處理組。

空白對照組：細胞培養基中不加入任何藥物。魚藤酮組：細胞培養基中加入魚藤酮孵育24 h。單純槲皮素處理組：細胞培養基中加入槲皮素孵育24 h。槲皮素加魚藤酮處理組：細胞培養基中加入槲皮素預處理2 h后，加入魚藤酮，二者共同孵育24 h。

2.3PC12細胞凋亡形態學的觀察 將PC12細胞接種于6孔板內的蓋玻片，待細胞貼壁生長24 h后,各實驗組給以不同因素處理24 h。小心棄去上清，加入PBS清洗3次，加入新鮮配制的 4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS清洗3次，加Dapi染液室溫避光染色3 min(Dapi 1 mg/L)，用封片液(20 mmol/L 檸檬酸，50 mmol/L磷酸氫二鈉，50%甘油，pH 5.5)封片后熒光顯微鏡下觀察并攝片。

2.4Annexin V/PI流式細胞分析法檢測細胞凋亡 每組3孔合并后按文獻方法進行[6]。用0.25%的胰酶消化細胞，懸浮于無血清DMEM-F12中，4 ℃、1 000 r/min 離心5 min，預冷PBS洗1次，重懸400目篩網過濾，計數。調整細胞密度為1×109cells/L，取100 μL細胞懸液加入5 μL Annexin V-FITC(20 mg/L)和2.5 μL PI(250 mg/L)，輕輕混勻，避光冰上放置15 min，加入400 μL預冷1×binding buffer輕輕振蕩，轉至流式細胞儀檢測管，30 min內完成檢測。

2.5Western blotting 檢測Bax、Bcl-2的表達 收集細胞，提取細胞總蛋白，用Bradford法測定含量，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉膜，室溫封閉2 h，Ⅰ抗4 ℃孵育(Bax、Bcl-2的抗體稀釋濃度均為1∶1 000)過夜，Ⅱ抗室溫孵育2 h，顯影，凝膠成像儀照相并分析蛋白條帶灰度值。

2.6JC-1染色檢測細胞線粒體膜電位 經藥物處理24 h后，6孔板每孔加200 μL JC-1(10 mg/L)，37 ℃、5%CO2培養箱中孵育15 min。37℃ DMEM-F12清洗2次，再用37 ℃ PBS清洗1次，用不含EDTA的胰酶消化收集細胞。室溫、1 500 r/min 離心2 min，樣品緩沖液重懸細胞，上流式細胞儀檢測。以發射波長590 nm紅色熒光值與530 nm綠色熒光值百分比表示線粒體膜電位。

3統計學處理

結 果

1細胞凋亡的形態學觀察

經Dapi染色，空白對照組可見細胞核出現彌漫均勻的低強度熒光,見圖 1A；1.6 μmol/L魚藤酮作用PC12細胞24 h后，出現大量的細胞核呈濃染致密的固縮形態或是顆粒狀熒光的凋亡細胞，見圖1B；300 μmol/L槲皮素和魚藤酮同時處理時，呈固縮狀態的細胞核數明顯減少，大部分細胞染色質呈均勻的低密度藍光,見圖 1C,提示槲皮素可明顯減輕魚藤酮誘導PC12細胞的凋亡作用。

2流式細胞儀檢測細胞凋亡

正常活細胞Annexin V及PI均低染，分布于流式細胞分析圖的左下區(LL)；早期凋亡細胞Annexin V高染而PI低染，分布于圖的右下區(RL)；晚期凋亡或死亡細胞Annexin V及PI均高染，分布于圖的右上區(RU),見圖 2；將早期凋亡細胞百分數和晚期凋亡細胞百分數總和稱為總凋亡率。結果顯示，空白對照組及單純槲皮素處理組僅有少量凋亡細胞，分別為3.6%±1.7%和4.6%±2.2%。魚藤酮組可見較多的凋亡細胞24.7%±3.3%，較空白對照組明顯增多(n=3,P<0.01)。槲皮素加魚藤酮處理組可見散在的凋亡細胞6.3%±1.9%，較魚藤酮組明顯減少(n=3，P<0.01)。提示槲皮素可降低魚藤酮誘導的PC12細胞凋亡。

Figure 1. Effect of quercetin on apoptosis induced by rotenone in PC12 cells (×200). A: control; B: rotenone (1.6 μmol/L); C: rotenone (1.6 μmol/L)+ quercetin (300 μmol/L); D:quercetin (300 μmol/L).

圖1槲皮素對魚藤酮誘導PC12細胞凋亡形態的影響

Figure 2. FACS analysis of annexin V/PI in apoptotic cells. A: control; B: rotenone (1.6 μmol/L); C: rotenone (1.6 μmol/L)+ quercetin (300 μmol/L); D:quercetin (300 μmol/L).

圖2AnnexinV/PI流式細胞儀檢測細胞凋亡

3Westernblotting檢測Bax、Bcl-2蛋白表達情況

圖3所示，魚藤酮誘導損傷后Bcl-2的表達下降，Bax的表達增加，與之相比，槲皮素加魚藤酮處理組Bcl-2的表達明顯增加，Bax的表達明顯減少(P<0.01)。結果表明槲皮素對抗魚藤酮誘導的凋亡與調節凋亡相關蛋白的表達有關。

圖3Westernblotting檢測Bax、Bcl-2蛋白表達

4線粒體膜電位的檢測

線粒體親脂性陽離子染料JC-1特異性地進入線粒體，分布和結合在線粒體基質上，線粒體膜電位的高低變化決定了JC-1的分布濃度。藥物作用24 h后，檢測PC12細胞胞內線粒體膜電位的改變。結果顯示， 1.6 μmol/L魚藤酮處理組可明顯降低線粒體膜電位，紅/綠熒光強度比值下降(P<0.01)；槲皮素加魚藤酮處理組紅/綠熒光強度比值較魚藤酮處理組明顯增加(P<0.01)，提示槲皮素可一定程度上逆轉魚藤酮誘導的線粒體膜電位減低。單純槲皮素處理組紅/綠熒光強度比值與空白對照組差異不顯著(P>0.05),見圖4。

圖4槲皮素對PC12細胞線粒體膜電位的影響

討 論

近年來大量研究發現，細胞凋亡可能在PD的黑質多巴胺能神經元死亡中起重要作用[7,8]。不同類型的環境毒素或(和)遺傳變異可分別誘發氧化應激，α-突觸核蛋白的異常折疊聚集及小膠質細胞激活等，每個因素都可能成為啟動因子，并誘發其它因素的損害機制[9]。這種相互協同作用形成了不斷加強的“正反饋”效應，使原本單一因素的損害作用在多巴胺神經元內被不斷擴大。這可能是多巴胺神經元選擇性和進行性丟失的關鍵因素，而細胞凋亡則是其主要形式[10]。

Bcl-2蛋白家族與PD細胞凋亡密切相關。目前研究發現神經細胞的抗凋亡基因bcl-2、bcl-xl的啟動子區含有雌激素受體反應元件，雌激素可使Bcl-2表達的蛋白量升高，使1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)小鼠模型中腦黑質TH陽性神經元數目增加，凋亡細胞數目減少[11]。過表達Bcl-2可以通過拮抗Bax的激活、減少活性氧片段生成，從而阻止多巴胺誘導的凋亡[12]。羅蔓等[13]研究發現雌激素主要通過與Bcl-2家族蛋白的作用，上調Bcl-2蛋白與下調Bax蛋白的表達來實現其細胞保護作用。Ishikawa等[14，15]認為，對于多種類型的正常細胞來說，槲皮素都有阻止其細胞凋亡發生的效應。

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，廣泛分布于自然界各種植物的花、葉、果實之中，本實驗應用Dapi染色法觀察到，槲皮素可明顯減少呈固縮狀態的細胞核，大部分細胞染色質呈均勻的低密度藍光。經Annexin V/PI流式細胞分析法，觀察到槲皮素可以明顯地抑制魚藤酮誘導的PC12細胞凋亡。Western blotting檢測Bax、Bcl-2蛋白經槲皮素作用后的表達情況，結果顯示槲皮素通過下調Bax蛋白與上調Bcl-2蛋白的表達來實現其細胞保護作用。

凋亡信號從最初產生到細胞形態學變化及DNA片段化的產生需經歷一定時間，而線粒體跨膜電位丟失是凋亡程序中一個極早期的事件。Bcl-2蛋白家族作用于線粒體滲透性轉換(permeability transitionpore,PT)孔，通過改變線粒體膜的通透性來調節PD細胞凋亡。線粒體PT孔和線粒體內致凋亡的多種蛋白釋放均受Bcl-2家族調控。因此，我們應用線粒體親脂性陽離子染料JC-1觀察藥物作用24 h后，PC12細胞胞內線粒體膜電位的改變。結果提示，槲皮素可一定程度上逆轉魚藤酮誘導的線粒體膜電位下降。

本實驗結果表明，槲皮素對PD具有保護作用，我們推測槲皮素可能通過與Bcl-2家族蛋白的作用，上調Bcl-2蛋白與下調Bax蛋白的表達來維持線粒體結構和功能的穩定性，發揮細胞凋亡主開關的作用。因此，若能進一步明確槲皮素對PD保護作用的機制，將有助于指導新型抗PD藥物的開發。

[1] Nutt JG,Wooten GF.Diagnosis and initial management of Parkinson’s disease[J].N Engl J Med,2005,353(10):1021-1027.

[2] Rodriguez-Perez AI,Valenzuela R, Villar-Cheda B,et al. Estrogen and angiotensin interaction in the substantia nigra. Relevance to postmenopausal Parkinson’s disease[J].Exp Neurol,2010,224(2):517-526.

[3] 陳 偉,謝瑞滿.雌激素和帕金森病[J].國際中華應用心理學雜志,2006,3(1):67-69.

[4] Saunders PR,Gordon EJ,Parides M,et al.The effect of estrogen replacement on early Parkinson’s disease[J].Neurology,1999,52(7):1417-1421.

[5] Jagtap S, Meganathan K, Wagh V, et al. Chemoprotective mechanism of the natural compounds, epigallocatechin-3-O-gallate, quercetin and curcumin against cancer and cardiovascular diseases[J]. Curr Med Chem,2009,16(12):1451-1462.

[6] 范常龍，欒 彥，陳 燕，等.氯唑沙腙對抗HepG2腫瘤細胞的作用研究[J].中國藥理學通報,2007,23(9):1198-1202.

[7] Radad K,Gille G,Rausch WD,et al.Dopaminergic neurons are preferentially sensitive to long-term rotenone toxicity in primary cell culture[J].ToxicolInVitro,2008,22(1):68-74.

[8] Mather AA,Cox BJ,Enns MW,et al.Associations between body weight and personality disorders in a nationally representative sample[J].Psychosom Med,2008,70(9):1012-1019.

[9] 陶恩祥,張國華,徐 杰,等.利福平對魚藤酮處理的大鼠多巴胺神經元的保護作用[J].中國病理生理雜志,2008,24(9):1751-1756.

[10]Burke RE,Kholodilov NG.Programmed cell death:does it play a role in Parkinson’s disease?[J].Ann Neurol,1998,44(3 Suppl 1):S126-S133.

[11]Subramanian M,Shaha C.Oestrogen modulates human macrophage apoptosis via differential signaling through oestrogen receptor-alpha and beta[J].J Cell Mol Med,2009,13(8B):2317-2329.

[12]Lud Cadet J,Harrington B,Ordonez S,et al.Bcl-2 overexpression attenuates dopamine-induced apoptosis in an immortalized neural cell line by suppressing the production of reactive oxygen species[J].Synapse,2000,35(3):228-233.

[13]羅 蔓,謝瑞滿.雌激素減輕β淀粉樣蛋白所致PC12細胞毒活性的機制[J].中國老年保健醫學,2006,4(3):33-36.

[14]Ishikawa Y, Kitamura M.Bioflavonoid quercetin inhibits mitosis and apoptosis of glomerular cellsinvitroandinvivo[J].Biochem Biophys Res Commun, 2000,279(2):629-634.

[15]Ishikawa Y, Kitamura M.Anti-apoptotic effect of quercetin: intervention in the JNK- and ERK-mediated apoptotic pathways[J].Kidney Int,2000,58(3):1078-1087.

InhibitoryeffectofquercetinonapoptosisofPC12cellsinducedbyrotenone

BI Wei1, ZHU Li-hong2, WANG Chuan-ming1, LIANG Yan-ran1, TAO En-xiang1

(1DepartmentofNeurology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China;2DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:taoenxiang@yahoo.com.cn)

AIM: To observe the effects and mechanisms of quercetin on the apoptosis of PC12 cells induced by rotenone.METHODSPC12 cells were used in the study. Quercetin at the concentration of 300 μmol/L was added into the PC12 cells cultured in DMEM-F12 medium with 10% fetal calf serum. The morphological changes of the cells were observed under fluorescence microscope. The apoptotic rate was determined by flow cytometry assay. The protein levels of Bax and Bcl-2 were determined by Western blotting, and the mitochondrial membrane potential was measured by ratiometric probe JC-1.RESULTSIn the cells treated with rotenone+quercetin, the morphology of the cells was significantly improved, and the apoptotic rate was decreased to 6.7%, significantly lower than that in the cells treated with rotenone alone (P<0.01). The expression of Bcl-2 was up-regulated and Bax was down-regulated in rotenone+quercetin group (P<0.01), while the mitochondrial membrane potential was also increased (P<0.01) as compared to those in rotenone group.CONCLUSIONPretreatment of quercetin inhibits the development of apoptosis in PC12 cells induced by rotenone. One of the mechanisms may be correlated with up-regulating the expression of Bcl-2 and down-regulating the expression of Bax, thus maintaining mitochondrial membrane potential.

Quercetin; Rotenone; Apoptosis; PC12 cells; Parkinson disease

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.016

1000-4718(2011)01-0082-04

2010-07-22

2010-10-19

廣東省自然科學基金資助項目(No.2005B33801003)；教育部高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(No.20070558257)

△ 通訊作者Tel:020-81332095; E-mail: taoenxiang@yahoo.com.cn

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