異氟醚和七氟醚對新生大鼠皮質凋亡以及JNK和p38表達的不同影響*

李玉娟， 柳垂亮， 張 靜， 陳偉強， 曾敏婷

(1中山大學附屬孫逸仙紀念醫院麻醉科， 2廣東省中醫院麻醉科， 廣東 廣州 510120)

異氟醚和七氟醚對新生大鼠皮質凋亡以及JNK和p38表達的不同影響*

李玉娟1△， 柳垂亮2， 張 靜1， 陳偉強1， 曾敏婷1

(1中山大學附屬孫逸仙紀念醫院麻醉科，2廣東省中醫院麻醉科， 廣東 廣州 510120)

目的研究同等劑量的異氟醚和七氟醚對新生大鼠皮質神經元凋亡的影響以及對JNK和p38蛋白表達的不同影響。方法55只出生后7 d(P7)的新生大鼠(共5窩，每窩取11只)，隨機均分為異氟醚組(Ⅰ組)、七氟醚組(S組)和對照組(C組)，各組分別吸入1.1%異氟醚、1.8%七氟醚和空氣4 h。在麻醉結束后2 h每窩每組各取1只幼鼠灌注取腦，免疫組織化學法檢測皮質壓部后區caspase-3表達(n=5)；另外，每窩C組在麻醉處理0 h，Ⅰ組和S組分別在麻醉2 h、4 h取新鮮腦皮質，Western blotting檢測磷酸化SAPK/JNK、磷酸化p38，以及SAPK/JNK、p38表達的變化(n=5)。結果Ⅰ組和S組caspase-3表達分別較對照組增加441%(P<0.01)和151%(P<0.01)，Ⅰ組比S組增加115%(P<0.05)；Ⅰ組磷酸化SAPK/JNK表達在麻醉2 h和4 h較對照組分別增加219%(P<0.05)和181%(P<0.05)，S組在2 h和4 h均與對照組無顯著差異；Ⅰ組磷酸化p38表達在麻醉2 h和4 h較對照組分別增加38.9%(P<0.05)和36.9%(P<0.05)，S組在2 h和4 h較對照組分別增加32.6%(P<0.05)和128.0%(P<0.01)。結論0.5最低肺泡有效濃度(MAC)異氟醚比七氟醚誘導更多新生大鼠大腦皮質神經元凋亡，異氟醚誘導凋亡可能與激活SAPK/JNK磷酸化有關，而七氟醚誘導凋亡可能與激活p38磷酸化有關。

異氟醚； 七氟醚； 腦； 有絲分裂素激活蛋白激酶類

異氟醚和七氟醚均屬于吸入麻醉藥，常用于臨床手術麻醉。它們對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用[1]，但近年來國內外有多篇文章報道異氟醚能誘導突觸發育高峰期的動物腦神經元凋亡增加，以及成年期認知功能改變[2-7]，引起對麻醉藥物神經毒性作用的關注。我們前期體外實驗研究發現七氟醚比異氟醚對神經元的毒性更小[8]，因此假設七氟醚對新生幼鼠的神經毒性也比異氟醚低。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)信號通路在細胞生長分化以及細胞凋亡的調節中起著重要作用，MAPKs主要包括EKR1/2(extracellular signal-regulated kinase,)、SAPK/JNK(stress-activated protein kinases/c-Jun NH2-terminal kinases)和p38 MAPK 3個主要的亞家族。正常情況下，ERK、JNK和p38可促分化，而在應激狀態下，ERK起抗凋亡作用，JNK和p38則起促凋亡作用。缺血、缺氧、炎癥反應等各種刺激均可引起MAPKs的磷酸化狀態改變。許多研究證實JNK和p38通路激活在腦、心臟等的缺血再灌注的病理損傷起著重要作用[9，10]。

異氟醚和七氟醚如果對新生大鼠神經毒性存在差異，這種差異是否與JNK和p38的通路的不同激活有關？本研究擬采用給新生大鼠吸入1.1%異氟醚或1.8%七氟醚[相當于0.5最低肺泡有效濃度(minimum alveolar concentration,MAC)]4 h的實驗模型，通過對鼠腦皮質凋亡和磷酸化SAPK/JNK、p38蛋白表達變化的檢測來研究異氟醚和七氟醚對P7新生大鼠腦發育影響的差異，并初步探討其機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1儀器與試劑 Detax麻醉氣體檢測儀(歐米達公司)，Olympus IX70 倒置顯微鏡 (奧林巴斯公司)，血糖儀(拜爾公司)，i-STAT血氣分析儀(雅培有限公司)；異氟醚(雅培有限公司)，七氟醚(百特醫療用品有限公司)。兔抗大鼠磷酸化SAPK/JNK多克隆抗體、兔抗大鼠SAPK/JNK多克隆抗體(Cell Signaling)；小鼠抗大鼠磷酸化p38單克隆抗體、小鼠抗大鼠磷酸化p38單克隆抗體、β-actin單克隆抗體(碧云天生物技術公司)。羊抗兔Ⅱ抗、羊抗小鼠Ⅱ抗(武漢博士德公司)。

1.2動物及分組 55只出生后7 d(P7)的新生大鼠(總共5窩，每窩取11只，由廣東省動物中心提供)，隨機分為異氟醚組(Ⅰ組)、七氟醚組(S組)和對照組(C組)。在麻醉4 h時每窩每組各取1只幼鼠經心臟穿刺抽血，檢測血糖和血氣(n=5)。麻醉結束后2 h每窩每組各取1只進心臟灌注，取腦組織制作石蠟切片，免疫組織化學法檢測皮質caspase-3表達(n=5)；另外，每窩C組在麻醉0 h、Ⅰ組和S組分別在麻醉2 h和4 h取新鮮腦皮質，Western blotting檢測磷酸化SAPK/JNK和磷酸化p38，以及SAPK/JNK和p38表達的變化(n=5)。

2方法

2.1麻醉處理 將新生大鼠放置于密閉麻醉箱中，該麻醉箱放置于預設溫度為35 ℃的水浴箱中。麻醉箱與麻醉機相連，Ⅰ組使用1.1%異氟醚處理4 h，S組使用1.8%七氟醚處理4 h，麻醉氣體通過麻醉機的揮發罐由壓縮空氣輸送通過該麻醉箱。幼鼠呼氣末麻醉氣體的濃度、氧氣和二氧化碳濃度由連接于麻醉箱的麻醉氣體監測儀監測。C組暴露于空氣中4 h。

2.2生理指標監測 在麻醉過程中每隔30 min監測幼鼠膚色，記錄呼吸頻率，在麻醉4 h時每窩每組各取1只幼鼠經左心室心臟穿刺抽血行血氣分析和血糖檢測(n=5)。

2.3組織準備 每窩C組在麻醉處理0 h、Ⅰ組和S組分別在麻醉2 h和4 h取1只幼鼠，斷頭取腦，冰上分離腦皮質，液氮速凍后轉移至-80 ℃保存，組織用來做Western blotting分析。在麻醉結束后2 h每窩每組各取1只幼鼠，經心臟灌注4%多聚甲醛固定液15 min后取腦。腦組織在同樣的灌注液中4 ℃后固定48 h后梯度脫水，石蠟包埋，經冠狀平面切取5 μm連續石蠟切片，參照幼鼠腦解剖圖譜，每只幼鼠選擇3個相同的海馬平面的切片進行免疫組化染色。

2.4免疫組化法檢測細胞凋亡 組織切片通過梯度乙醇脫蠟、水化、抗原修復，3% H2O2室溫孵育5 min以去除內源性過氧化物酶活性。10%正常羊血清封閉液室溫封閉1 h，1∶100 caspase-3抗體4 ℃孵育過夜，羊抗兔Ⅱ抗(1∶200，武漢博士德公司)室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素反染。使用IP lab 7.0和 Olympus IX70 倒置顯微鏡獲得大腦皮質壓部后區(retrosplonial cortex,RS)200倍圖像，2個人分別計數caspase-3陽性細胞數，并計算單位面積的陽性細胞數的均值。

2.5Western blotting法檢測MAPK通路 新鮮冰凍的腦皮質勻漿后提取蛋白，根據其蛋白濃度(BAC法測定)，各樣本等量蛋白10%SDS-DEPG電泳，轉膜，1∶500兔抗大鼠磷酸化SAPK/JNK多克隆抗體，1∶500兔抗大鼠磷酸化p38單克隆抗體，1∶1 000兔抗大鼠SAPK/JNK多克隆抗體以及1∶1 000兔抗大鼠p38多克隆抗體4 ℃孵育過夜，1∶1 000Ⅱ抗室溫孵育2 h，使用ECL(Amersham公司)進行膠片顯影。

3統計學處理

結 果

1生理指標檢測

Ⅰ組和S組幼鼠在麻醉處理過程中呼吸均勻，膚色紅潤，脈搏血氧飽和度(SPO2)均>95%，無1例出現呼吸抑制。各組pH值均在正常范圍無顯著差異(C組：7.39±0.55；Ⅰ組：7.37±0.89；S組：7.38±0.78)。各組均無低血糖發生，C組為(4.56±0.53) mmol/L，Ⅰ組為(8.08±0.76) mmol/L，S組為(5.46±0.33) mmol/L。3組間血糖差異顯著(P<0.01)。Ⅰ組比C組和S組血糖明顯增加(均P<0.01)，S組與C組血糖差異無顯著。

2大腦皮質caspase-3表達的變化

免疫組化染色顯示3組大腦皮質壓部后區caspase-3陽性表達有明顯差異，見圖1A。C組RS區單位面積的caspase-3陽性染色細胞數為(5.92±1.05)個/mm2，Ⅰ組為(32.02 ±6.74)個/mm2和S組為(14.89±2.28)個/mm2。Ⅰ組和S組caspase-3表達分別較C組增加441%(P<0.01)和151%(P<0.01)，Ⅰ組比S組增加115%(P<0.05),見圖1B。

圖1新生鼠腦皮質壓部后區caspase-3表達的免疫組化結果

3磷酸化SAPK/JNK表達的變化

Ⅰ組磷酸化SAPK/JNK在麻醉2 h和4 h分別較對照組增加了219%(P<0.05)和181%(P<0.05)，S組磷酸化SAPK/JNK在麻醉2 h和4 h與對照組無顯著差異，而且Ⅰ組4 h比S組4 h增加了41.5%(P<0.05),見圖2。提示SAPK/JNK通路在異氟醚麻醉的早期就已經激活，而七氟醚可能沒有激活該通路。

4磷酸化p38表達的變化

Ⅰ組磷酸化p38表達在麻醉2 h和4 h較對照組增加38.9%(P<0.05)和36.9%(P<0.05)，S組在2 h和4 h較對照組增加32.6%(P<0.05)和128.0%(P<0.01)，S組4 h較2 h增加72.3%(P<0.05)，S組4 h較Ⅰ組4 h增加66.8%(P<0.05),見圖3。提示異氟醚輕度激活p38通路，而七氟醚在麻醉2 h輕度激活p38通路，4 h能顯著激活該通路。

討 論

在各種誘導的神經退行性改變的模型中，神經細胞凋亡被認為是細胞損傷的潛在機制。目前已有多篇研究報道吸入麻醉藥異氟醚可以引起腦突觸發育高峰期的動物神經元凋亡[2-7]。Jevtovic等[2]報道0.75%異氟醚6 h可誘導P7新生大鼠腦區出現神經元凋亡，與咪唑安定和氧化亞氮聯合使用凋亡程度更大，并且會導致成年期學習記憶功能減退。單獨使用異氟醚麻醉P7新生鼠0.75%4 h、1.50%2 h和2.00%1 h，均可誘導鼠腦出現廣泛凋亡[5]，而異氟醚不會增加新生鼠神經元凋亡的最高濃度為0.55%[6]。有關豚鼠的研究也發現0.55%異氟醚麻醉4 h就誘導caspase-3增加3至6倍[7]。作為目前臨床廣泛使用的吸入麻醉藥七氟醚是否也具有同樣的神經毒性，與MAPK通路中的蛋白改變是否有關系是本研究關注的重點。

我們前期研究使用PC12細胞和原代培養的皮質神經元模型已經證明異氟醚比七氟醚的毒性更大，誘導更多的caspase-3和caspase-9表達[8]，因此本研究擬在整體動物實驗中進一步證實同等劑量的七氟醚比異氟醚誘導更小程度的細胞凋亡。本研究的實驗模型是選用1.1%異氟醚或1.8%七氟醚麻醉P7新生大鼠4 h。腦突觸發育的高峰期在嚙齒類為出生后2周[11]，人類為妊娠晚期至出生后3歲。本研究選擇P7的新生大鼠作為研究對象，腦發育階段相當于人類成熟的新生兒期。根據Orliaguet等[12]的研究，P9新生大鼠的MAC濃度異氟醚為2.34%，七氟醚為3.74%。本研究選用P7新生大鼠與P9新生大鼠年齡接近，因此推斷本研究中1.1%異氟醚和1.8%七氟醚的麻醉深度相當于0.5MAC。而Liang等[13]認為0.75%的異氟醚和1.1%的七氟醚相當于0.5MAC，主要是他們使用的動物為小鼠，參考文獻及標準不一致所致。在預試驗中我們使用1.5%異氟醚麻醉新生大鼠1 h，新生鼠出現明顯的呼吸抑制，而1.1%異氟醚和1.8%七氟醚麻醉新生幼鼠4 h，新生鼠沒有出現呼吸抑制，血氣檢測在正常范圍內，各組均無低血糖發生，而且異氟醚組的血糖高于其它2組。因此，本研究使用該麻醉劑量作為研究，排除了呼吸抑制、低血糖等生理性干擾對細胞凋亡和蛋白表達結果的影響。

圖2Westernblotting檢測0.5MAC異氟醚和七氟醚麻醉新生大鼠2h和4h磷酸化SAPK/JNK的變化

圖3Westernblotting分析0.5MAC異氟醚和七氟醚麻醉新生大鼠2h和4h磷酸化p38的變化

本研究的結果發現0.5 MAC七氟醚誘導新生鼠腦皮質RS區caspase-3的表達明顯少于異氟醚組，七氟醚組比對照組增加1.5倍，而異氟醚組比對照組增加4.4倍。這與最近Liang等[13]研究的結果一致，他們使用1.1%七氟醚和0.75%異氟醚麻醉P7新生小鼠6 h，也發現七氟醚誘導海馬神經元凋亡的程度比異氟醚要小，但是2種藥物都不會影響大鼠青少年期的空間學習能力。本研究檢測到的單位面積細胞凋亡數目比他們報道的少，這主要是由于檢測的腦區不同所致，Li等[14]研究的為海馬CA1區神經細胞，而本研究選擇的是皮質RS區神經元。我們前期研究也發現單位面積海馬神經元的凋亡數目比皮質RS區要多近10倍。但兩項研究結果中異氟醚和七氟醚對神經元凋亡影響的趨勢是一致的。Zhang等[15]研究發現1.7%七氟醚麻醉2 h可誘導P5-P7的C57BL/6小鼠腦皮質神經元caspase-3表達增加4倍，大于本研究中七氟醚增加的幅度，主要與檢測的時點選擇不同有關。他們選擇麻醉后12 h，此時為caspase-3陽性表達高峰期。而Bercker等[16]使用3-5%七氟醚麻醉P6 d的Wister新生大鼠6 h，caspase-3表達與對照組無明顯差異，可能是他們選擇24 h后檢測已經難以檢測到caspase-3陽性的細胞。

異氟醚和七氟醚誘導神經元凋亡的機制目前研究尚未完全明確。有研究證實異氟醚與咪唑安定和氧化亞氮聯合使用通過激活BDNF神經元凋亡通路[4]而激活內源性線粒體通路，4 h后也激活外源性通路誘導凋亡[3]。我們前期細胞研究發現異氟醚能通過激活內質網IP3受體比七氟醚誘導更高的細胞漿鈣離子濃度[17]，而且異氟醚顯著降低Bcl-2/Bax比值[8]。而這兩種吸入麻醉藥誘導發育期神經細胞凋亡與MAPKs信號通路的關系尚未見報道。本研究在整體動物實驗中發現異氟醚在麻醉早期就顯著增加磷酸化SAPK/JNK表達2倍多，并持續至麻醉4 h，而對磷酸化p38也有激活，但增加幅度不大，提示異氟醚誘導神經元凋亡可能激活SAPK/JNK和p38這兩條通路有關，但激活SAPK/JNK更明顯。而七氟醚對磷酸化SAPK/JNK影響不大，而在麻醉4 h顯著增加磷酸化p38表達超過1倍，提示七氟醚誘導神經元凋亡可能與激活p38通路有關。由于誘導凋亡的信號通路有許多，是否這兩條通路激活肯定參與了異氟醚和七氟醚誘導的神經元凋亡，尚不能完全定論。如果確實相關，異氟醚對神經毒性的誘導過程SAPK/JNK和p38哪一條通路的激活更重要，下游的哪些信號蛋白被激活，這些都需要進一步實驗證明。

總之，本研究通過給P7新生大鼠吸入同等劑量(0.5MAC)的異氟醚和七氟醚4 h，發現異氟醚比七氟醚均可以增加腦皮質神經元凋亡，而異氟醚增加神經元凋亡的程度比七氟醚更顯著。異氟醚誘導凋亡可能主要與激活SAPK/JNK磷酸化有關，而七氟醚誘導凋亡可能與激活p38磷酸化有關。

本研究也存在一定的局限性，沒有同時使用SAPK/JNK和p38的拮抗劑來進一步證實異氟醚和七氟醚誘導的神經元凋亡與這兩條通路的激活相關性，沒有研究caspase-3激活與這兩條通路的因果關系，缺乏行為學實驗的結果來評價這兩種藥物的長期影響，在后續的研究中將繼續完善。總之，本研究結果證明0.5 MAC異氟醚比七氟醚誘導P7新生大鼠更嚴重的神經元凋亡，可能與它們不同地激活SAPK/JNK和p38磷酸化有關。研究提示七氟醚的神經毒性作用小于異氟醚，在嬰幼兒和小兒手術中使用可能更加安全。

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EffectsofisofluraneandsevofluraneonapoptosisofcorticalneuroninneonatalratsandtheroleofMAPKspathway

LI Yu-juan1, LIU Chui-liang2, ZHANG Jing1, CHEN Wei-qiang1, ZENG Min-ting1

(1DepartmentofAnesthesiology,TheSunYat-senHospitalofSunYat-senUniversity,2DepartmentofAnesthesiology,TCMHospitalofGuangdongProvince,Guangzhou510120,China.E-mail:yujuan_04@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the effects of isoflurane and sevoflurane at the same dose on apoptosis of cortical neuron in neonatal rats and the role of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) pathway.METHODSEleven neonatal rats were selected at postnatal day 7 from 1 litter (altogether 5 litters) and assigned randomly into control group (C group), isoflurane group (Ⅰ group) and sevoflurane group (S group). The rats in Ⅰ group, S group or C group were exposed to 1.1% isoflurane, 1.8% sevoflurane[ (equivalent to 0.5 minimum alveolar concentration(MAC)] and room air for 4 h, respectively. The brain of neonatal rats were perfused and embedded by paraffin. Caspase-3 positive expression in the retrosplenial cortex (RS) of the brain was observed by immunohistochemical staining. Meanwhile, the fresh cortex was separated at 0 h in C group and at 2 h and 4 h in Ⅰ group and S group. The levels of phospho-SAPK/JNK and SAPK/JNK, phospho-p38 and p38 in fresh cortex were detected by Western blotting.RESULTSCaspase-3 positive cells in the the cortex were increased by 441% in Ⅰ group (P<0.01) and 151% in S group (P<0.01) as compared to C group, and increased by 115% in Ⅰ group (P<0.05) as compared to S group. The protein levels of phospho-SAPK/JNK in the cortex were increased by 219% at 2 h (P<0.05) and 181% at 4 h (P<0.05) in Ⅰ group, while no significant difference between S group and C group was observed. The phospho-p38 protein in the cortex was increased by 38.9% at 2 h (P<0.05) and 36.9% at 4 h (P<0.05) in Ⅰ group, and increased by 32.6% (P<0.05) at 2 h and 128.0% at 4 h (P<0.01) in S group as compared to C group.CONCLUSIONIsoflurane induces more apoptotic neurons in the cortex of the brain in neonatal rats at postnatal day 7 than sevoflurane. Isoflurane induces apoptosis mainly by activating SAPK/JNK phosphorylation, while sevoflurane induces aopotosis by activating p38 phosphorylation.

Isoflurane; Sevoflurane; Brain; Mitogen-activated protein kinases

R729

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.014

1000-4718(2011)01-0072-05

2010-08-02

2010-10-16

國家自然科學基金資助項目(No. 30700787)；廣東省自然科學基金資助項目(No.8151040701000062)

△通訊作者 Tel：020-81332060; E-mail: yujuan_04 @yahoo.com.cn