通心絡(luò)對同型半胱氨酸損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜的影響*

陳燕銘， 吳 琳， 劉 勇， 周 彬， 王 敏， 劉定輝， 廖火城， 吳偉康， 吳以嶺， 錢孝賢,△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1內(nèi)分泌科，2心血管內(nèi)科，3中山大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所， 廣東 廣州 510630；4河北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)藥研究院，河北 石家莊 050035)

通心絡(luò)對同型半胱氨酸損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜的影響*

陳燕銘1， 吳 琳2， 劉 勇2， 周 彬2， 王 敏2， 劉定輝2， 廖火城2， 吳偉康3， 吳以嶺4， 錢孝賢2,3△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1內(nèi)分泌科，2心血管內(nèi)科，3中山大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所， 廣東 廣州 510630；4河北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)藥研究院，河北 石家莊 050035)

目的探討通心絡(luò)對同型半胱氨酸(Hcy)損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的基因表達(dá)譜的影響。方法原代培養(yǎng)的HUVECs，隨機(jī)分為對照組、Hcy組和通心絡(luò)組，提取總RNA并純化，反轉(zhuǎn)錄合成熒光分子(Cy3/Cy5)標(biāo)記的cDNA探針，采用高通量Affymetric人類全基因組寡核苷酸微陣列芯片(含47 000個基因或基因片段)雜交，雜交信號經(jīng)掃描和數(shù)字化處理，通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析推測通心絡(luò)對同型半胱氨酸損傷的HUVECs細(xì)胞功能的影響以及可能的信號通路。結(jié)果與對照組相比，Hcy組有4 343個基因表達(dá)上調(diào)，316個基因表達(dá)下調(diào)；與Hcy組相比，通心絡(luò)組有3 409個基因表達(dá)上調(diào)，121個基因表達(dá)下調(diào)。這些共同的差異基因生物功能涉及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、激酶、細(xì)胞骨架與蛋白合成、轉(zhuǎn)運(yùn)功能、細(xì)胞因子、細(xì)胞-細(xì)胞受體相互作用和細(xì)胞黏附因子等。參與的信號通路主要是與血管新生、凋亡、氧化應(yīng)激、凝血纖溶和炎癥等相關(guān)的信號通路,如mTOR信號通路、MAPK信號通路和Toll樣受體信號通路。結(jié)論通心絡(luò)能導(dǎo)致同型半胱氨酸損傷內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜的改變，這些基因改變可能參與了細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和凝血纖溶等過程。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； 高半胱氨酸； 通心絡(luò)； 基因芯片； 基因表達(dá)譜

通心絡(luò)膠囊是根據(jù)絡(luò)病理論研制的復(fù)方制劑，近年來大量臨床和動物實驗研究表明，通心絡(luò)可改善內(nèi)皮功能、抗氧自由基、抗動脈粥樣硬化，減輕心肌缺血-再灌注損傷等作用[1,2]。其中，對內(nèi)皮細(xì)胞功能的保護(hù)作用是通心絡(luò)的心腦血管保護(hù)作用的重要途徑之一。內(nèi)皮細(xì)胞不僅具有屏障作用，而且具有內(nèi)分泌、調(diào)控血管舒縮等復(fù)雜的生理作用。同型半胱氨酸是近年來證實的心血管疾病獨(dú)立危險因子[3]，研究證明血管內(nèi)皮是同型半胱氨酸作用的重要靶器官。目前，通心絡(luò)對同型半胱氨酸損傷的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制尚不明了。本實驗采用高通量表達(dá)譜基因芯片-人類全基因組寡核苷酸微陣列芯片[4](CapitalBio, China)對同型半胱氨酸損傷的內(nèi)皮細(xì)胞及通心絡(luò)對內(nèi)皮細(xì)胞的影響的可能基因組mRNA水平進(jìn)行全基因組篩查，并采用生物信息學(xué)方法對結(jié)果進(jìn)行分析，旨在揭示通心絡(luò)對內(nèi)皮細(xì)胞作用的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1芯片 全基因組寡核苷酸芯片HG-U133 Affymetric plus 2.0，包含54 614個探針組，分析47 000個轉(zhuǎn)錄體和變異體，其中包括了可能的38 500個已知基因。

1.2儀器與試劑 通心絡(luò)超微粉膠囊由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供。Poly-A RNA Control Kit，Hybridization Control Kit，R-phycoerythrin Streptavidin，Hybridization Oven 640，F(xiàn)luidics Station 450，GeneChip Scanner 3000均為Affymetrix產(chǎn)品。

1.3通心絡(luò)超微粉溶液的制備 通心絡(luò)超微粉溶液的制備用M199培養(yǎng)液溶解通心絡(luò)超微粉，配置為50 g/L原液，室溫條件下，充分振蕩30 min，超聲溶解1 min，1 000 r/min離心10 min，取上清用于細(xì)胞培養(yǎng)。

2方法

2.1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)原代培養(yǎng)及鑒定 健康新生兒臍帶取自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科；參考Jaffe改良法，無菌收集新生兒臍帶，PBS緩沖液反復(fù)沖洗靜脈腔后灌注0.1%膠原酶消化30 min，含10%血清的M199培養(yǎng)基終止消化，消化液1 000 r/min離心5 min后加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞數(shù)量，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁并85%融合后，用0.05%胰酶消化傳代，選擇生長良好的第3-5代用于實驗。HUVECs經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定，而且流式細(xì)胞術(shù)CD34檢測陽性證實。

2.2實驗分組 細(xì)胞同步化后，分為對照組(培養(yǎng)液不加干擾因素)、同型半胱氨酸 (homocysteine,Hcy)組(0.5 mol/L)和通心絡(luò)組(Hcy 0.5 mol/L+通心絡(luò) 5 g/L)，上述各組藥物干預(yù)48 h。

2.3樣品RNA的準(zhǔn)備 干預(yù)結(jié)束,吸干培養(yǎng)液，洗滌細(xì)胞后用Trizol(Invitrogen)一步法提取細(xì)胞中的總RNA，采用RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen)對總RNA進(jìn)行純化。采用分光光度計分析RNA濃度和純度。

2.4熒光標(biāo)記和基因芯片雜交 按CapitalBio公司實驗操作流程進(jìn)行，將Cy3-dCTP和Cy5-dCTP(GE Healthcare) 分別標(biāo)記不同來源細(xì)胞總RNA 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，標(biāo)記產(chǎn)物純化后于Hybridization Oven 640中雜交。雜交結(jié)束后在Fluidics Station 450洗脫和染色。

2.5掃描、圖像的采集與數(shù)據(jù)分析 采用GeneChip Scanner 3000進(jìn)行掃描，用GeneChip Operating software (GCOS 1.4)分析軟件對芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號；然后dChip軟件做校正和歸一化處理。

2.6表達(dá)基因的篩選和差異基因的信息學(xué)分析 刪除熒光信號弱的基因(<1 500)，以及芯片上的陰性對照、內(nèi)標(biāo)、外標(biāo)等冗余的數(shù)據(jù)，2張雜交膜中相同點(diǎn)的信號強(qiáng)度進(jìn)行比較得出該基因的信號比值(Cy5/Cy3)，以>2或<0.5倍標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因，信號比值>2表示基因上調(diào)，而<0.5則表示基因下調(diào)。在進(jìn)行生物信息學(xué)分析時，把篩選出的差異表達(dá)基因?qū)φ誎EGG(www.genome.jp/kegg/)和BioCarta(www.biocarta.com)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行途徑分析(pathway analysis)。

2.7驗證芯片結(jié)果 我們挑選4個差異表達(dá)基因做實時定量RT-PCR，操作按試劑說明書和儀器操作規(guī)程。在ABI Prism 7000熒光定量PCR分析儀進(jìn)行擴(kuò)增及定量分析。本實驗設(shè)定β-actin為管家基因。引物序列見表1。

表1 實時定量PCR的基因序列

3統(tǒng)計學(xué)處理

所有基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析均采用Affymetrix公司的GCOS 1.2軟件對獲得的各雜交點(diǎn)的信號值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。將有顯著表達(dá)差異的基因，上傳到Affymetrix分析中心MAS平臺 (Molecule Annotation System)(http://bioinfo. capitalbio.com/mas/)進(jìn)行資料分析，獲取每個探針的信息。利用KEGG pathway和Gene Ontology (Go) (http://www.Geneontology.org)分析差異基因在信號通路上的富集程度及分子功能和生物學(xué)過程的分類。熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后由計算機(jī)自動計算定量結(jié)果，用△△Ct方法進(jìn)行計算RNA表達(dá)量。利用SPSS 13.0 配對樣本t檢驗比較基因芯片實驗和定量PCR實驗?zāi)康幕虮磉_(dá)差異統(tǒng)計。將目的基因的相對差異表達(dá)水平與Affymetrix芯片實驗結(jié)果進(jìn)行比較，判定兩者是否一致。

結(jié) 果

1樣本和芯片質(zhì)量控制結(jié)果

實驗中提取的總RNA 所進(jìn)行的凝膠電泳及分光光度計分析，證實獲得了高質(zhì)量的總RNA。OligoB2、Poly-A controls、hybridization controls等陽性對照信號正常；看家基因信號值及3’/5’比值正常；平均背景值與噪音值較低；present percent數(shù)值正常；證實各質(zhì)控指標(biāo)符合要求。

2差異表達(dá)基因

選擇表達(dá)差異≥2倍為表達(dá)上調(diào)基因，而≤0.50倍為表達(dá)下調(diào)基因。各基因的雜交信號強(qiáng)度分布見圖1，該圖中每一個數(shù)據(jù)點(diǎn)代表芯片上一個基因點(diǎn)的雜交信號，X軸、Y軸分別代表Cy3和Cy5的信號強(qiáng)度，大部分集中在一個接近45°的對角線周圍的紅點(diǎn)，代表信號差異在0.5-2.0的倍區(qū)間，基本屬于非差異性表達(dá)基因，而一些黃點(diǎn)分布在45°的對角線外，這些點(diǎn)可能是差異表達(dá)基因。

分析表明，相比Hcy組，對照組共有4 659個基因出現(xiàn)表達(dá)差異，其中，4 343個基因表達(dá)上調(diào)，316個基因表達(dá)下調(diào)，部分差異表達(dá)基因見表2。對比Hcy組，TXL組共有3 530個基因出現(xiàn)表達(dá)差異，其中3 409個基因表達(dá)上調(diào)，121個基因表達(dá)下調(diào)，部分差異表達(dá)基因見表3。比較TXL組和正常對照組，僅有59個基因出現(xiàn)表達(dá)差異，其中，29個基因表達(dá)上調(diào)，30個基因表達(dá)下調(diào)。

Figure 1. Scatter spots of hybridization signals on gene chip. A: Hcyvscontrol; B: HcyvsTongxinluo; C: Tongxinluovscontrol.

圖1表達(dá)譜芯片雜交信號強(qiáng)度雙對散點(diǎn)圖

表2 Hcy組vs對照組的差異基因

Cy5/Cy3 ratio>2:up-regulative gene; Cy5/Cy3 ratio<0.5:down-regulative gene.

表3 Hcy組 vs 通心絡(luò)組的差異基因

Cy5/Cy3 ratio>2:up-regulative gene; Cy5/Cy3 ratio<0.5:down-regulative gene.

3通路分析

通過比對KEGG和BioCarta 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異基因的途徑分析表明，2張芯片(Hcyvscontrol; HcyvsTXL)共同差異基因的可能相關(guān)途徑列于表4中。其中，影響較大的是凋亡(apoptosis)信號通路、促絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信號途徑和mROT信號通路等，包括細(xì)胞-細(xì)胞受體相互作用、細(xì)胞黏附分子、脂肪細(xì)胞因子信號途徑、氧化應(yīng)激等與內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡、物質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激等的途徑均受到影響。部分信號通路見表4。

4實時定量RT-PCR驗證基因芯片結(jié)果

基因芯片結(jié)果與定量RT-PCR的改變倍數(shù)(表5)雖然有差異，變化趨勢一致，且差異無顯著(P>0.05，n=4)，證明基因芯片結(jié)果可靠。

表4 差異基因的信號通路

表5實時定量RT-PCR與基因芯片結(jié)果比較

Table 5. Testing result comparison of real-time RT-PCR and gene chip(n=4)

GenesGenechipReal-timeRT-PCRHcyvscontrolHcyvsTXLHcyvscontrolHcyvsTXLPRKACB3.012.762.512.36FAS4.123.575.214.87CASP82.282.213.783.57MAP2K42.872.754.545.21

討 論

高同型半胱氨酸血癥是動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險因子之一，其在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用尚未明了。其中血管內(nèi)皮細(xì)胞是同型半胱氨酸的重要靶器官。通心絡(luò)膠囊是運(yùn)用中醫(yī)絡(luò)病理論研制的復(fù)方中藥制劑。目前針對同型半胱氨酸所致動脈粥樣硬化的致病機(jī)制研究大部分仍局限在少數(shù)幾個基因、蛋白的比較分析范疇內(nèi)，對通心絡(luò)心血管保護(hù)作用的探索也較局限，一般僅在通路水平上進(jìn)行探討[5]，這樣所提供的信息單一，難以較全面地認(rèn)識相關(guān)基因的表達(dá)狀況。大量研究證明，基因和蛋白質(zhì)較少單獨(dú)起作用，它們往往通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)交互作用共同影響生物系統(tǒng)的功能，這些功能高度相關(guān)的基因構(gòu)成基因群。動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中存在著極其復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[6]基因芯片是一項高通量篩選技術(shù)，具有高通量、自動化、高效率、平行等優(yōu)點(diǎn)，通過少量標(biāo)本的分析，能夠全面地反映疾病基因表達(dá)譜。

GO是Gene Ontology(GO)Consortium(http://www.geneontology.org/)制定的動態(tài)受控性詞匯表[7]，GO分析是將差異基因進(jìn)行分類，從中發(fā)現(xiàn)不同樣本的主要差別。GO將基因分為3大類：分子功能(molecular function)、生物學(xué)過程(biological process)和細(xì)胞成分(cellular component)。在GO分析中，我們選擇可信度P=0.02，所選擇的類別中2個組差別明顯。(1)在生物學(xué)過程中，生物調(diào)節(jié)相關(guān)的差異表達(dá)基因主要集中在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、凋亡調(diào)節(jié)、細(xì)胞活性、細(xì)胞黏附及細(xì)胞定位和功能調(diào)控這些功能群，這提示Hcy及通心絡(luò)參與了細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、增殖和凋亡等關(guān)系細(xì)胞損傷、修復(fù)的生理過程；(2)在分子功能中，差異基因主要集中在催化活性、結(jié)合作用、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶調(diào)節(jié)活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、電子載體活性及結(jié)構(gòu)蛋白活性等，這些生物功能的改變與細(xì)胞增殖速度、分裂速度、細(xì)胞修復(fù)的核酸復(fù)制及較復(fù)雜的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程相關(guān)；(3)在細(xì)胞成分中，大部分集中在細(xì)胞器、蛋白結(jié)合物及大分子復(fù)合物中，其次是膜內(nèi)腔、胞外區(qū)等，提示Hcy可能因?qū)?xì)胞損傷導(dǎo)致部分細(xì)胞器活性提高甚至出現(xiàn)細(xì)胞器形態(tài)學(xué)改變，通心絡(luò)可以部分改善Hcy對細(xì)胞成分的影響。按照基因功能分類的GO標(biāo)準(zhǔn)，我們對差異基因進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)這些基因是涉及凋亡相關(guān)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)、轉(zhuǎn)錄相關(guān)、免疫相關(guān)、生長分化相關(guān)和細(xì)胞周期相關(guān)等不同層次、不同功能的基因，很多基因都參與多種生物學(xué)過程，具有多種分子功能，形成網(wǎng)絡(luò)，因此難以單純地歸為某一類。

KEGG-日本基因和基因組京都百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系統(tǒng)分析基因功能、聯(lián)系基因組信息和功能信息的知識庫[8]，通過更高級的KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫中，可以詳細(xì)了解細(xì)胞生化過程如代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號傳遞、細(xì)胞周期，還包括同系保守的子通路等信息。經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)分析，Hcy組對比正常組的差異基因中共有81組差異的信號通路，其中38個信號通路差異非常顯著(P<0.01)。Hcy組對比通心絡(luò)組的差異基因中，共有63組差異的信號通路，其中41個信號通路差異非常顯著(P<0.01)。將這2批信號通路進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)共有26組信號通路是共同擁有的，其中包括凋亡通路、MAPK通路、JAK-STAT通路、mTOR通路、VEGF通路及Toll樣受體通路等與氧化應(yīng)激、炎癥及免疫反應(yīng)、凝血纖溶系統(tǒng)等病理生理過程相關(guān)的重要信號通路，同時提示通心絡(luò)可能通過上述信號通路對同型半胱氨酸損傷內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)是細(xì)胞內(nèi)促增殖和傳遞應(yīng)激信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心環(huán)節(jié)，該家族包括ERK 、JNK、p38等亞族。MAPK可通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白、酶類等底物參與介導(dǎo)生長、發(fā)育、分裂、分化、死亡及細(xì)胞間的功能同步等細(xì)胞生理過程。MAPK磷酸酶激活多種轉(zhuǎn)錄因子，影響基因表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。鑒于MAPK與氧化應(yīng)激、炎癥密切相關(guān)，因此在動脈粥樣硬化的發(fā)生過程中起重要作用。研究證明，通心絡(luò)可通過激活JNK通路[9]、上調(diào)NOS-NO通路[10]改善內(nèi)皮細(xì)胞功能。本研究發(fā)現(xiàn)MAPK通路中3個亞族中的多個相關(guān)基因如PPP3CA、MAP3K7、MAP2K1IP1、RAPGEF2、ZAK表達(dá)均有顯著差異，提示Hcy與氧化應(yīng)激、炎癥過程密切相關(guān)。

本研究通過對同型半胱氨酸損傷內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜的研究，發(fā)現(xiàn)通心絡(luò)能改善同型半胱氨酸損傷內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜，這些基因改變可能參于了細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和凝血纖溶等過程，今后可進(jìn)一步研究通心絡(luò)作用的信號通路。

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EffectofTongxinluoongeneexpressionprofilesofendothelialcellstreatedwithhomocysteine

CHEN Yan-ming1, WU Lin2, LIU Yong2, ZHOU Bin2, WANG Min2, LIU Ding-hui2, LIAO Huo-cheng2, WU Wei-kang3, WU Yi-ling4, QIAN Xiao-xian2,3

(1DepartmentofEndocrinology，2DepartmentofCardiology，3InstituteofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineofSunYat-senUniversity,ThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;4TheIntegrationofTraditionalandWesternMedicalResearchAcademyofHebeiProvince,Shijiazhuang050035,China.E-mail:xiaoxianq@qq.com)

AIM: To explore the effects of Tongxinluo on the gene expression profiles of homocysteine-treated human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).METHODSThe cell injury model was established by treating the HUVECs with homocysteine. Cultured HUVECs were divided into 3 groups: control group (without any treatment), homocysteine group (treated with homocysteine at the concentration of 0.5 mol/L) and Tongxinluo group (trated with homocysteine+Tongxinluo). The total RNA isolated from the cells with Trizol method was purified and reversely transcribed for synthesizing Cy3/Cy5 labeled cDNA probe. The probe was hybridized with microarray-based Affymetric high throughput gene expression profile (47 000 genes or gene fragments) to screen the differentially expressed genes among the cells with different treatment. The effect of Tongxinluo on the biological function of HUVECs and the possible signal pathway were analyzed.RESULTSCompared with the control cells, 4 659 (9.91%) genes were detected to have marked changes with 4 343 up-regulated and 316 down-regulated expression in homocysteine treated cells. Compared with the cells treated with homocysteine, 3 530 (7.51%) genes were detected to have marked changes with 3 409 up-regulated and 121 down-regulated expression in the cells treated with homocysteine+Tongxinluo. These genes were involved in transcription activators, cytoskeleton and protein biosynthesis, transport function, cytokines, cell adhesion molecule and metabolism. Signal pathway analysis indicated that Tongxinluo played roles in certain pathways related to vascular proliferation, apoptosis, oxide stress, coagulation, fibrinolysis and inflammation, such as mTOR, MAPK and Toll-like receptor signaling pathways.CONCLUSIONTongxinluo alters the gene expression profiles of HUVECs injury induced by homocysteine, resulting in the change and modification of cell apoptosis, oxide stress, coagulation and fibrinolysis.

Human umbilical vein endothelial cells; Homocysteine; Tongxinluo; Gene chip; Gene expression profile

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.008

1000-4718(2011)01-0042-06

2010-06-24

2010-11-17

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃973資助項目(No.2005CB523305);廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No.8151008901000209)；廣東省科技計劃資助項目(No.2007B060401024)

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