E1A激活基因阻遏子促進(jìn)人血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF分泌和單層通透性增加*

王占勝， 韓雅玲， 康 建， 張效林， 陶 杰， 田孝祥， 閆承慧

(1沈陽軍區(qū)總醫(yī)院全軍心血管病研究所心內(nèi)科， 遼寧 沈陽 110016；2大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 116044)

E1A激活基因阻遏子促進(jìn)人血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF分泌和單層通透性增加*

王占勝2， 韓雅玲1△， 康 建1， 張效林1， 陶 杰1， 田孝祥1， 閆承慧1

(1沈陽軍區(qū)總醫(yī)院全軍心血管病研究所心內(nèi)科， 遼寧 沈陽 110016；2大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 116044)

目的探討E1A激活基因阻遏子(CREG)誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)單層通透性改變中的作用及機(jī)制。方法用CREG過表達(dá)及CREG表達(dá)下調(diào)的ECs為模型，Transwell chamber彌散模型觀察ECs單層通透性的改變； 熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞骨架肌動蛋白F-actin及黏附連接蛋白VE-cadherin在ECs中的分布和形態(tài)學(xué)改變；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測ECs血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)分泌。結(jié)果CREG過表達(dá)的ECs (EO組) 較EN組單層通透性明顯增高 (P<0.05)；CREG表達(dá)下調(diào)的ECs(ES組)較EN組單層通透性有所下降(P<0.05)。與EN組相比較，EO組細(xì)胞中F-actin排列紊亂，形成大量應(yīng)力纖維； ES組F-actin則主要呈細(xì)絲狀分布于細(xì)胞周邊，中央分布較少。同時，EO組VE-cadherin在細(xì)胞周邊的正常拉鏈狀結(jié)構(gòu)減少或缺失，細(xì)胞間隙增寬；而ES組VE-cadherin在細(xì)胞周邊呈正常拉鏈狀分布，細(xì)胞之間連接緊密。ELISA檢測顯示EO組細(xì)胞上清中VEGF分泌較EN組明顯增加(P<0.05)；ES組VEGF分泌較EN組減少(P<0.05)。應(yīng)用VEGF中和抗體阻斷后，CREG過表達(dá)引起的EO通透性增加的現(xiàn)象明顯受到抑制。結(jié)論CREG過表達(dá)可能通過VEGF介導(dǎo)的信號途徑引起F-actin重構(gòu)及VE-cadherin減少，使血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性增加。

E1A激活基因阻遏子； 血管內(nèi)皮細(xì)胞； VE-cadherin； 細(xì)胞骨架； 通透性； 血管內(nèi)皮生長因子

人類心肌血管新生治療為冠心病的治療提供了一種新的方法，通過調(diào)節(jié)血管的生成及增加心肌血管的密度，可以提高心肌的灌注，改善患者的癥狀和提高勞動能力[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白改變，內(nèi)皮細(xì)胞收縮或回縮，血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附連接蛋白VE-cadherin破壞，細(xì)胞間隙增大，引起血管通透性增加則是血管新生序列事件中重要的始動環(huán)節(jié)。因此，闡明血管內(nèi)皮通透性改變的機(jī)制，尋找促進(jìn)血管新生調(diào)控的活性分子，對缺血性疾病的防治具有重要意義。

本室先前研究已證實(shí)[2-4]，E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes, CREG)在胚胎血管發(fā)育早期即開始表達(dá)，參與了血管發(fā)生的調(diào)控。并且，進(jìn)一步研究證實(shí)，CREG是血管平滑肌細(xì)胞成熟分化的重要調(diào)控因子，參與了血管成熟穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。但目前關(guān)于CREG在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的生物學(xué)作用尚未見報(bào)道。本研究以體外培養(yǎng)的人血管ECs系(VE)為研究對象，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體分別介導(dǎo)CREG在VE細(xì)胞中過表達(dá)及表達(dá)下調(diào)，觀察CREG表達(dá)對動脈ECs單層通透性的影響并探討其調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的機(jī)制及其與內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑 抗CD31單克隆抗體購于Sigma；抗CREG多克隆抗體購于R&D；Biotin-BSA購于Sigma；異硫氰酸四甲基羅丹明-鬼筆環(huán)肽(TRITC-phalloidin)購于Sigma；抗VE-cadherin多克隆抗體購于Sigma；抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothe-lial growth factor,VEGF)中和抗體購于R&D。

1.2細(xì)胞來源 人血管ECs 細(xì)胞系VE購自ATCC，我室已建立感染pLNCX-CREG 逆轉(zhuǎn)錄病毒的過表達(dá)(over expressing)CREG 蛋白VE細(xì)胞株命名為EO、感染pLNCX-shRNA-CREG 病毒CREG表達(dá)沉默(suppression)的VE細(xì)胞株命名為ES；轉(zhuǎn)染的空載體對照組的VE細(xì)胞株命名為EN。上述細(xì)胞株均在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，2-3 d傳代1次。

2方法

2.1Western blotting檢測CREG蛋白的表達(dá) 采用BCA法測定細(xì)胞裂解液中蛋白濃度,并進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合及顯色。Ⅰ抗為CREG多克隆抗體(1∶1 000)，Ⅱ抗為HRP標(biāo)記IgG(1∶2 000)，按ECL試劑盒(Amersham)說明書進(jìn)行檢測顯影。

2.2ECs單層通透性檢測 參照Essler等[5]建立的方法，用示蹤劑Biotin-BSA檢測ECs單層通透性變化。將ECs接種在12孔Transwell chamber (0.4 μm pore size，12 mm diameter)多聚碳脂濾膜的彌散模型中，每個小室鋪3×105個細(xì)胞，各設(shè)置2個復(fù)孔，置37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4 h后棄去未貼壁細(xì)胞，生長4 d細(xì)胞融合成單層后用于實(shí)驗(yàn)。在上室中加入Biotin-BSA使其為終濃度為100 mg/L，作用30 min后，分別從下室取60 μL培養(yǎng)基置于96孔板，加入鏈霉親和素-過氧化物酶，TMB顯色10 min，然后加入2 mol/L H2SO450 μL終止反應(yīng)，Bio-Rad 550型酶標(biāo)儀在波長470 nm處檢測吸光度變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。

2.3免疫熒光法檢測ECs的F-actin肌動蛋白的分布 將3組ECs接種于清潔滅菌的蓋玻片上，待生長融合至細(xì)胞單層后，用37 ℃的PBS洗3次，4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定15 min，0.2% Triton X-100 通透15 min，加入1%BSA磷酸緩沖液封閉1 h，用100 μg/L的TRITC-phalloidin[TRITC最大吸收波長為(540±25) nm，最大發(fā)射波長為(608±32) nm]進(jìn)行F-actin肌動蛋白染色，置暗處反應(yīng)60 min，30%甘油-PBS封片，在熒光倒置顯微鏡下觀察肌動蛋白細(xì)胞骨架F-actin的分布變化。

2.4免疫熒光法檢測ECs黏附連接蛋白VE-cadherin改變 將3組ECs培養(yǎng)在清潔滅菌的蓋玻片上，待生長融合至細(xì)胞單層后，用37 ℃的PBS洗3次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.2% Triton X-100室溫通透15 min，PBS洗滌3次后，5%山羊血清封閉30 min，加入抗人VE-cadherin抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，加入熒光標(biāo)記Ⅱ抗(1∶100)室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，甘油封片，在熒光倒置顯微鏡下觀察VE-cadherin表達(dá)的變化。

2.5酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測ECs的VEGF分泌 將3組ECs在60 mm培養(yǎng)皿中融合至80%左右，棄去培養(yǎng)基，無菌PBS洗滌10 mL×3次，盡量吸盡殘留液體，加無血清的DMEM 4 mL(以盡量少的液體覆蓋細(xì)胞表面)，置37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集上清，進(jìn)行VEGF的ELISA檢測，根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前以細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果校對上樣量，使上樣量保持一致。紫外透射儀讀取結(jié)果，每次實(shí)驗(yàn)讀數(shù)取3個，重復(fù)5次。

2.6抗VEGF中和抗體阻斷實(shí)驗(yàn) 同時應(yīng)用抗VEGF中和抗體(0.5 mg/L)對3組內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)處理12 h，用Transwell chamber嵌套裝置按前述方法測定ECs單層的通透性。應(yīng)用抗VEGF中和抗體(0.5 mg/L)對3組ECs預(yù)處理12 h后，按前述方法進(jìn)行ECs肌動蛋白骨架F-actin及黏附連接蛋白VE-cadherin的免疫熒光染色及觀察。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1Westernblotting檢測CREG蛋白的表達(dá)

結(jié)果顯示，ES組CREG表達(dá)量明顯減少，經(jīng)計(jì)算CREG表達(dá)量為正常組的48.9%(對β-actin比值比為0.42±0.01，P<0.05)。EO組CREG表達(dá)量與對照組EN相比表達(dá)量明顯增高(1.20±0.03，P<0.05)，增加了38.2%，見圖1。

圖1Westernblotting檢測分析3組ECs的CREG表達(dá)量

2CREG過表達(dá)增加ECs單層的通透性

在Western blotting檢測上述各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中CREG的表達(dá)基礎(chǔ)上，應(yīng)用示蹤劑Biotin-BSA檢測發(fā)現(xiàn)，CREG過表達(dá)的EO細(xì)胞單層通透性明顯增加(0.0490±0.0016)，與EN對照組(0.0376±0.0061)比較差異顯著(P<0.05)。同時，CREG表達(dá)沉默的ES組單層通透性下降(0.0324±0.0114)，與EN對照組(0.0376±0.0061)比較差異顯著(P<0.05)，見圖2，結(jié)果提示CREG過表達(dá)引起內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加。

3CREG過表達(dá)引起ECs肌動蛋白骨架F-actin重排和VE-cadherin表達(dá)減少

應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察，可見EN組細(xì)胞連接緊密，F(xiàn)-actin主要分布于細(xì)胞周邊，呈“花環(huán)”樣排列，少量呈細(xì)絲狀無序地分布于胞漿，核周偶有應(yīng)力纖維形成。而CREG過表達(dá)的EO組細(xì)胞中的F-actin則明顯呈向心性回縮， F-actin邊聚現(xiàn)象消失，胞漿內(nèi)的F-actin明顯增多，出現(xiàn)大量應(yīng)力纖維，并呈典型的竹排樣結(jié)構(gòu)。CREG表達(dá)沉默的ES組細(xì)胞中F-actin分布與EN組相似，主要分布于細(xì)胞周邊，中心也有少量分布。進(jìn)一步應(yīng)用免疫組化檢測細(xì)胞中黏附連接蛋白VE-cadherin，發(fā)現(xiàn)EN組和ES細(xì)胞中VE-cadherin在單層融合血管內(nèi)皮細(xì)胞的周邊呈正常拉鏈狀排列，細(xì)胞之間連接緊密。EO組細(xì)胞中VE-cadherin分布明顯減少，同時細(xì)胞間隙增寬，見圖3。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CREG過表達(dá)引起內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白重排和細(xì)胞間隙連接蛋白表達(dá)下降。

圖2Transwell測量3組ECs通透性的結(jié)果

Figure 3. Immunocytochemical staining of F-actin and VE-cadherin in different groups.

圖3免疫熒光染色觀察3組ECs的F-actin及VE-cadherin的變化

4VEGF介導(dǎo)CREG誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮通透性改變

ELISA檢測3組細(xì)胞上清中VEGF的結(jié)果顯示，與EN組(577.20±10.43) ng/L相比，CREG過表達(dá)的EO組細(xì)胞中VEGF分泌最高(1 392.00±5.83) ng/L，而CREG沉默的ES中VEGF最低(391.40±4.04)，三者(EO組、EN組、ES組)間差異顯著(P<0.05),見圖4。加入VEGF中和抗體后，EO組細(xì)胞單層通透性下降至(0.0388±0.0013)與處理前(0.0490±0.0017)比較差異顯著(P<0.05),見圖5A；同時細(xì)胞F-actin應(yīng)力纖維解聚，見圖5B，VE-cadherin回復(fù)為細(xì)胞周邊拉鏈狀分布，見圖5C。

圖4ELISA方法檢測培養(yǎng)基中VEGF的分泌

圖5VEGF中和抗體對CREG誘導(dǎo)ECs通透性改變及F-actin、VE-cadherin表達(dá)的影響

討 論

CREG是1998年Gill等首次從HeLa細(xì)胞系克隆出來的，研究證實(shí)CREG是一種分泌型糖蛋白，其在多種細(xì)胞中發(fā)揮抑制增殖和促進(jìn)分化的作用。我室前期研究表明CREG過表達(dá)可通過PI3K-Akt途徑促進(jìn)體外培養(yǎng)的人動脈ECs的遷移；可通過PI3K途徑促進(jìn)動脈ECs的增殖[6]。由此我們可以推測CREG可能是正常血管維持穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控蛋白，對于血管正常生理功能起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，CREG過表達(dá)可誘導(dǎo)ECs通透性增加，促進(jìn)ECs的VEGF分泌。CREG引起ECs通透性增高時，一方面，ECs的肌動蛋白細(xì)胞骨架解聚，出現(xiàn)大量的應(yīng)力纖維，加入VEGF中和抗體后，F(xiàn)-actin分布向細(xì)胞膜處轉(zhuǎn)移，細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力纖維形成有所減少；另一方面，EO組ECs的VE-cadherin在ECs周邊的正常鏈狀染色減少或脫失，加入VEGF中和抗體后，VE-cadherin在血管內(nèi)皮細(xì)胞周邊的正常染色增多，提示CREG引起F-actin重新分布、VE-cadherin在ECs周邊的正常鏈狀染色減少或脫失及增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的作用可能是通過VEGF介導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)的。CREG表達(dá)下調(diào)可減低ECs通透性，減少ECs的VEGF分泌，使F-actin主要分布在ECs周邊，VE-cadherin在ECs周邊呈正常鏈狀染色，連接緊密，與EO組加入VEGF中和抗體后的表現(xiàn)相似，進(jìn)一步證實(shí)VEGF在CREG引起ECs單層通透性增高中介導(dǎo)的作用。促進(jìn)心肌缺血區(qū)血管新生的能力，進(jìn)而限制損傷區(qū)域，是缺血性心臟病治療的一個重要方法。ECs通透性增高是血管新生的一個重要環(huán)節(jié)，可使血漿蛋白溢出血管外，導(dǎo)致纖維蛋白在血管外凝結(jié)，形成血管生成的臨時基質(zhì)。這些基質(zhì)一方面促進(jìn)血管的生成，另一方面促使一些間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步形成成熟的血管基質(zhì)，從而有利于血管的生成。 因此探討ECs通透性改變及其機(jī)制研究尤為重要，目前認(rèn)為ECs單層通透性變化與F-actin的重新分布及VE-cadherin表達(dá)的減少和脫失有關(guān)。F-actin的變化可通過VE-cadherin的鏈狀結(jié)構(gòu)影響?zhàn)じ竭B接，使ECs間裂隙和內(nèi)皮通透性發(fā)生改變[7，8]。

總之，CREG作為一種新的具有維持血管穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控蛋白，其大量表達(dá)可以增加ECs的VEGF表達(dá)，而VEGF是一種特異性作用于血管ECs表面受體的生長因子，能夠維持血管正常狀態(tài)和完整性，增加血管通透性，誘導(dǎo)血管發(fā)生并促進(jìn)血管生成[9]。目前的研究表明CREG能夠促進(jìn)ECs的增殖和遷移[6]，而ECs穿過周圍細(xì)胞外基質(zhì)增殖和遷移是血管新生事件中的一個重要環(huán)節(jié)[10]。因此，CREG可以用于缺血性心肌梗死的促血管新生的治療?；赩EGF表達(dá)時程，在心肌梗死中血管生成活動可能是一個延遲反應(yīng)，那么，VEGF在亞急性及慢性階段是否可以應(yīng)用CREG調(diào)控VEGF的表達(dá)從而充分利用內(nèi)源性VEGF并獲得長期且最佳效果有待進(jìn)一步探討。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)發(fā)展，CREG有望成為缺血性心臟病治療的又一可靠、有效的手段。

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EffectsofcellularrepressorofE1A-stimulatedgenesonVEGFreleaseandmonolayerpermeabilityofhumanvascularendothelialcells

WANG Zhan-sheng2, HAN Ya-ling1, KANG Jian1, ZHANG Xiao-lin1, TAO Jie1, TIAN Xiao-xiang1, YAN Cheng-hui1

(1DepartmentofCardiology,GeneralHospitalofShenyangCommandofPLA,Shenyang110016,China;2DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China.E-mail:wzs20700079@163.com)

AIM: To study the effects and mechanism of cellular repressor of E1A-stimulated genes (CREG) on VEGF release and monolayer permeability of human vascular endothelial cells (ECs).METHODSThe monolayer permeability of ECs was measured by transwell chamber model. The expression and localization of F-actin and VE-cadherin were examined by immunofluroscence using Olympus IX-70 fluorescent microscope. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were performed to determine the concentration of vascular endothelial growth factors(VEGF) in the culture medium. VEGF neutrilization antibody was used to block the expression of VEGF in the cells.RESULTSThe monolayer permeability of CREG over-expressing ECs (EO group) was significantly higher than that of the normal control ECs (EN group,P<0.05). The monolayer permeability of CREG suppressing ECs (ES group) was lower than that in EN group (P<0.05). F-actin cytoskeleton in EO group showed disorganized, polymerized and bundled obviously to form large quantity of stress fibers in the central portion of the cells, whereas F-actin in EO group was mainly observed in the peripheral portion of the cells and only small amounts in the central portion of the cells. A widespread gap formation and a loss of VE-cadherin staining at the periphery were found in the cells of EO group. Inversely, the cells in ES group showed the localization of VE-cadherin at the cell-cell contacts tightly and the formation of zipper-like structures. Compared with EN group, the secretion of VEGF in the cell culture supernatants increased in EO group, but decreased in ES group (P<0.05). Furthermore, the changes of ECs permeability, cytoskeleton reorganization and loss of VE-cadherin induced by CREG were abolished by the addition of anti-VEGF neutralizing antibody.CONCLUSIONCREG over-expression increases the monolayer permeability of ECs, induces the cytoskeleton reorganization and reduces VE-cadherin expression by enhancing the secretion of VEGFinvitro.

Cellular repressor of E1A-stimulated genese; Vascular endothelial cells; VE-cadherin; Cytoskeleton; Permeability; Vascular endothelial growth factor

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.007

1000-4718(2011)01-0037-05

2010-04-13

2010-09-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30770793; No.30971218; No.30800465)

△通訊作者Tel：024-23056183; E-mail: wzs20700079@163.com