后處理對(duì)缺血再灌注損傷大鼠肺Egr-1和IL-1β表達(dá)的影響*

伍火志， 袁 江， 王理想， 劉 鑫， 黃清華

(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院心胸外科，廣東 珠海 519100)

后處理對(duì)缺血再灌注損傷大鼠肺Egr-1和IL-1β表達(dá)的影響*

伍火志△， 袁 江， 王理想， 劉 鑫， 黃清華

(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院心胸外科，廣東 珠海 519100)

目的研究后處理對(duì)在體缺血再灌注損傷大鼠肺早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1(Egr-1)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)表達(dá)的影響，并分析其可能的肺保護(hù)作用機(jī)制。方法建立大鼠在體肺臟缺血再灌注損傷模型，將SD大鼠24只隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組、缺血再灌注(I/R)組和缺血后處理(IPostC)組,每組8只。在體鼠I/R損傷模型制備完成后，阻斷左肺門(mén)，終止血供及通氣，造成左肺缺血，達(dá)預(yù)定時(shí)間后松開(kāi)阻斷帶恢復(fù)血供及通氣形成再灌注損傷。sham組只游離左側(cè)肺門(mén)、套阻斷帶但不阻斷，等待3 h后直接取標(biāo)本；I/R組缺血1 h后再灌注2 h；IPostC組缺血1 h后給予重復(fù)3次的5 min灌注和5 min缺血的后處理，繼以恢復(fù)血供行再灌注1.5 h。3組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后均留取左側(cè)肺組織，制成10%的組織勻漿，用于測(cè)定髓過(guò)氧化物酶(MPO)的含量；留取小塊肺組織測(cè)定肺濕/干重比(W/D)，并在光鏡下觀察肺組織的病理變化；RT-PCR法檢測(cè)Egr-1 mRNA及IL-1β mRNA的表達(dá)量。結(jié)果3組間各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)比較，差異均顯著(P<0.05)。與sham組比較，I/R組肺組織中Egr-1 mRNA、IL-1β mRNA的表達(dá)量、MPO的活性及W/D值均明顯升高(P<0.05)；肺組織炎癥反應(yīng)明顯加重。IPostC組肺組織中Egr-1 mRNA及IL-1β mRNA的表達(dá)量、MPO的活性及W/D值與I/R組相比均明顯下降(P<0.05)；肺組織炎癥反應(yīng)明顯減輕。結(jié)論后處理能夠明顯減輕大鼠肺缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與抑制Egr-1和IL-1β的表達(dá)有關(guān)。

肺缺血； 再灌注損傷； 后處理； 早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1； 白細(xì)胞介素1β

肺移植、肺栓塞血管再通、體外循環(huán)以及需暫時(shí)阻斷一側(cè)肺動(dòng)脈同期行血管成形術(shù)的中央型肺癌手術(shù)等過(guò)程中均可發(fā)生肺缺血再灌注損傷(ischemic reperfusion injury, IRI),導(dǎo)致術(shù)后肺功能障礙。從基因水平研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注肺組織中早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1(early growth response factor 1,Egr-1)的高表達(dá)，通過(guò)其下游基因白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)表達(dá)的參與，引起肺組織炎癥損傷，是導(dǎo)致肺缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制之一[1]。近年來(lái)，在對(duì)缺血再灌注損傷的組織和臟器保護(hù)措施的研究中，引入了缺血后處理的概念，即在再灌注開(kāi)始時(shí)，進(jìn)行重復(fù)多次的短暫灌注和缺血處理，從而起到器官保護(hù)作用[2-4]。我們已經(jīng)對(duì)離體缺血再灌注鼠肺進(jìn)行后處理的研究表明，后處理可以降低缺血再灌注肺中IL-6、IL-8等細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而減輕肺缺血再灌注損傷[5]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)建立在體肺缺血再灌注損傷模型，研究后處理對(duì)在體鼠肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，通過(guò)分析其對(duì)缺血再灌注肺組織中Egr-1和IL-1β表達(dá)的影響，從基因水平進(jìn)一步探討其可能的肺保護(hù)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 健康SD大鼠24只，雌雄不限，體重280-320 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、缺血再灌注組(I/R組)和缺血后處理組(IPostC組)每組8只。

1.2試劑 MPO試劑盒(南京建成生物有限公司)；PCR儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)；Trizol(Invitrogen)；FI/Rst Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)；Taq PCR Master Mix(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；引物合成(Invitrogen)。

2方法

取大鼠稱(chēng)重，以5%異戊巴比妥鈉(0.3 g/kg BW)行大鼠腹腔麻醉，麻醉成功后，氣管插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物有限公司)，通氣頻率90次/min，潮氣量2-3 mL/次，吸呼比1∶2，吸入空氣進(jìn)行輔助呼吸。右側(cè)臥位，消毒左胸部皮膚，沿左胸骨切斷第3-5肋軟骨，打開(kāi)胸腔，游離左肺門(mén)并穿過(guò)止血帶，靜脈注射肝素(1 mg/kg)抗凝。Sham組只游離肺門(mén)不阻斷，等待3 h直接取標(biāo)本；I/R組和IPostC組均阻斷肺門(mén)，終止血供及通氣造成左肺缺血，1 h后松開(kāi)阻斷帶恢復(fù)血供及通氣形成再灌注。IPostC組缺血1 h后給予重復(fù)3次的5 min灌注和5 min缺血的后處理，繼以恢復(fù)血供行再灌注1.5 h。

3肺濕/干重比(W/D)的計(jì)算

再灌注2 h后鉗夾切取左側(cè)肺組織稱(chēng)得的重量為濕重,隨即將該肺組織放入干燥箱內(nèi)以80 ℃的溫度鼓風(fēng)干燥12 h后稱(chēng)取的重量為干重,兩者之間的比值為肺濕/干重比。

4髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后留取小塊肺組織(約100 mg)，-40 ℃低溫保存，實(shí)驗(yàn)完成后統(tǒng)一制成組織勻漿，比色法檢測(cè)MPO的含量。

5光鏡觀察

切取小塊左肺上半部分用多聚甲醛固定做病理檢查。

6RT-PCR法檢測(cè)EGR-1mRNA及IL-1βmRNA表達(dá)水平

CRISPR/Cas9系統(tǒng)也有局限性。如存在一定的脫靶效應(yīng)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性取決于sgRNA上的識(shí)別序列。為了避免脫靶效應(yīng)，有必要將Cas9引導(dǎo)至其基因組中精確靶標(biāo)的sgRNA。為了確保Cas9的靶向活性和正常功能，使用Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)和Cas9表征的研究已經(jīng)證明需要與靶基因序列完美匹配[26-28]。有學(xué)者研發(fā)了很多軟件輔助CRISPR/Cas9系統(tǒng)快速篩選特定基因序列靶點(diǎn)，有針對(duì)性地避開(kāi)可能脫靶的位點(diǎn)，從而降低甚至消除脫靶現(xiàn)象[29]。

6.1RNA提取及RT-PCR反應(yīng) 稱(chēng)取凍存肺組織100 mg，以Trizol法勻漿提取總 RNA，紫外分光光度法測(cè)定其濃度與含量。取1μg總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。

6.2PCR 以β-actin為內(nèi)參照，采用50 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增。EGR-1:上游引物 5′-AAAGTTTGCCAGGAGTGAT-3′,下游引物5′-GCAGGAGACGGGTAGGTA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物 225 bp。IL-1β:上游引物 5′-CCTCTGTGACTCGTGGGA-3′,下游引物 5′-CTTCTTTGGGTATTGTTTGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物322 bp。β-actin：上游引物 5′-TGCCCATCTATGAGGGTTAC-3′,下游引物 5′-TGGAAGGTGGACAGTGAGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物 571 bp。 PCR 反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；擴(kuò)增31個(gè)循環(huán)(內(nèi)參照35個(gè)循環(huán))[95 ℃ 30 s，57 ℃(退火溫度)30 s，72 ℃ 30 s]，最后72 ℃延伸10 min。

6.3產(chǎn)物分析 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。結(jié)果用各樣品的條帶灰度值與β-actin的條帶灰度值之比表示。

7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1Egr-1mRNA及IL-1βmRNA的表達(dá)

應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，I/R組肺組織中Egr-1 mRNA及IL-1β mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于sham組，而IPostC組肺組織中Egr-1 mRNA及IL-1β mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于I/R組，3組間比較差異均顯著(P<0.05)，見(jiàn)表1及圖1、2。

表1各組Egr-1mRNA及IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)量

GroupEgr-1mRNArelativeexpressionIL-1βmRNArelativeexpressionSham0.2975±0.02890.2308±0.0083I/R0.6147±0.0152#0.5500±0.0281#IPostC0.4680±0.0166*0.3661±0.0080*

#P<0.05vssham group;*P<0.05vsI/R group.

Figure 1. Egr-1 mRNA expression detected by RT-PCR.

圖1RT-PCR檢測(cè)各組Egr-1mRNA的表達(dá)

Figure 2. IL-1β mRNA expression detected by RT-PCR.

圖2RT-PCR檢測(cè)各組IL-1βmRNA的表達(dá)

I/R組肺組織W/D及MPO活性明顯高于sham組，而IpostC組肺組織W/D及MPO活性則明顯低于I/R組，3組間比較差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2各組MPO活性和W/D的比較

GroupMPOactivityLungwet/dryratio(W/D)Sham1.1847±0.26364.4935±0.4171I/R2.2732±0.5593#6.6513±0.3820#IPostC1.6317±0.2015*5.5151±0.2693*

#P<0.05vssham group;*P<0.05vsI/R group.

3肺組織病理觀察

Sham組肺組織無(wú)明顯炎癥反應(yīng)。I/R組均出現(xiàn)不同程度的肺泡水腫，毛細(xì)血管破裂出血，肺間質(zhì)增寬并有水腫,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡內(nèi)有較多血液成分滲出,損傷明顯。IPostC組肺間質(zhì)輕度水腫,少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡較完整,見(jiàn)圖3。

Figure 3. Lung tissue sections were stained with HE for morphological evaluation(×200). A:sham group; B: I/R group; C: IPostC group.

圖3肺組織HE染色顯示假手術(shù)組、缺血再灌注組和后處理組的病理組織學(xué)變化

討 論

Egr-1是首先在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種核轉(zhuǎn)錄因子，控制多個(gè)下游基因的表達(dá)，涉及白細(xì)胞的募集與黏附、血液凝固及纖維化[6]。 當(dāng)機(jī)體受到機(jī)械損傷、躲避性應(yīng)激、細(xì)胞因子及缺氧等細(xì)胞外刺激后，受刺激的組織和細(xì)胞就會(huì)表達(dá)Egr-1。在鼠肺缺血再灌注損傷中，Egr-1 mRNA表達(dá)明顯升高，并局限于肺巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中，而且與野生型小鼠相比，Egr-1基因剔除小鼠體內(nèi)的炎癥介質(zhì)的水平、纖維蛋白的量及白細(xì)胞聚集明顯減少，生存期明顯延長(zhǎng)[7]。陳乾坤等[1]研究證實(shí)，在肺缺血再灌注損傷中，通過(guò)IL-1β的參與，Egr-1發(fā)揮重要的炎癥損傷作用，缺血再灌注可以誘導(dǎo)肺組織中Egr-1的表達(dá)在短時(shí)間內(nèi)迅速升高，而且其表達(dá)量隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增高。本實(shí)驗(yàn)中I/R組Egr-1 mRNA表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組，與以上研究結(jié)果相符，表明再灌注肺組織中Egr-1表達(dá)的升高是肺缺血再灌注損傷發(fā)生的原因之一。

利用大鼠肺缺血再灌注損傷模型，CO能抑制肺組織Egr-1的表達(dá)從而減輕白細(xì)胞淤滯和纖維素沉積，促進(jìn)氣體交換而延長(zhǎng)大鼠生存期[8]。應(yīng)用嗎替麥考酚酯可減少Egr-1的表達(dá)而減輕肺血管通透性、減少髓過(guò)氧化物酶含量及肺泡中白細(xì)胞計(jì)數(shù)[9]。說(shuō)明采取一定的干預(yù)措施可以抑制肺組織中Egr-1的表達(dá)。

在后處理減輕肺損傷機(jī)制的研究中，王繼武等[10]報(bào)道，給予在體大鼠重復(fù)5次的1 min灌注+1 min缺血的后處理，發(fā)現(xiàn)缺血后處理組的肺組織中脂質(zhì)代謝產(chǎn)物丙二醛含量較對(duì)照組明顯下降，而抗自由基酶超氧化物歧化酶活性明顯增加。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，后處理可以降低缺血再灌注肺中IL-6、IL-8等細(xì)胞因子的表達(dá)，減小中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而減輕肺缺血再灌注損傷[5]。魯建軍等[11]利用犬肺移植模型研究發(fā)現(xiàn)，缺血后處理可以減輕供體肺的缺血再灌注損傷，改善供體肺功能。本實(shí)驗(yàn)中IPostC組Egr-1 mRNA的表達(dá)量明顯低于I/R組，提示缺血后處理可以抑制缺血再灌注肺組織中Egr-1的表達(dá)，這可能是缺血后處理發(fā)揮肺保護(hù)作用的機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)Egr-1的下游基因IL-1β的表達(dá)的變化進(jìn)行了研究。前炎癥因子IL-1β主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，它的釋放是缺血再灌注損傷的機(jī)制之一[12]。結(jié)果表明，I/R組肺組織中IL-1β mRNA的表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組，而IPostC組肺組織中IL-1β mRNA的表達(dá)量則明顯低于I/R組，此結(jié)果與其上游基因Egr-1表達(dá)量的改變相一致，提示缺血后處理可以抑制缺血再灌注肺中IL-1β mRNA的表達(dá)，并且此作用可能與后處理抑制了IL-1β的上游基因Egr-1的表達(dá)密切相關(guān)。

中性粒細(xì)胞的活化及其所介導(dǎo)的炎癥損傷作用是肺缺血再灌注損傷的機(jī)制之一[13]。W/D反映肺組織的水腫程度，可直接評(píng)價(jià)組織炎癥損傷程度。本實(shí)驗(yàn)對(duì)各組肺組織W/D及MPO活性進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果表明，I/R組肺組織W/D及MPO活性明顯高于假手術(shù)組，病理切片顯示炎癥反應(yīng)明顯加重。而IPostC組肺組織W/D及MPO活性均明顯低于I/R組，病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)明顯減輕。肺組織Egr-1 mRNA的表達(dá)量與MPO的活性均呈正相關(guān)，提示后處理所引起肺組織炎癥反應(yīng)的改變與其抑制了Egr-1的表達(dá)密切相關(guān)。

綜上所述，缺血后處理能夠明顯減輕鼠肺缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與后處理抑制再灌注損傷鼠肺Egr-1及其下游基因IL-1β的表達(dá)有關(guān)。

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Effectofischemicpost-conditioningonEgr-1andIL-1βexpressioninischemia-reperfusioninjuredlunginrats

WU Huo-zhi, YUAN Jiang, WANG Li-xiang, LIU Xin, HUANG Qing-hua

(DepartmentofCardiothoracicSurgery,TheFifthAffiliatedHospital,ZunyiMedicalCollege,Zhuhai519100,China.E-mail:gary_wu5445@163.com)

AIM: To investigate the protective effects of ischemic post-conditioning on the expression of early growth response factor 1 (Egr-1) and interleukin-1β(IL-1β) in ischemia-reperfusion injured lung in rats.METHODSThe model of lung ischemia-reperfusion injury was established in 24 rats and the rats were randomly allocated to 3 different groups (n=8 in each group): (1) sham group: only sham operation (thoracotomy) and no ischemia for 3 h; (2)ischemia-reperfusion group (I/R group): interruption of pulmonary perfusion and ventilation for 1 h followed by reperfusion for 2 h; (3) ischemic post-conditioning group (IPostC group): ischemic post-conditioning (5 min of reperfusion and 5 min of ischemia for 3 times) between the end of ischemia and the beginning of the reperfusion followed by reperfusion for 1.5 h. The lung tissues (prepared to small pieces of about 20 mg) were collected and homogenized at the end of the experiment. The concentration of myeloperoxidase (MPO) in the homogenate was determined. The wet to dry weight ratio (W/D) of the lung tissues was also measured at the end of reperfusion. The pathological changes of the lung tissues were observed under light microscope after reperfusion. The mRNA expression of Egr-1 and IL-1β in the lung tissues was detected by RT-PCR.RESULTSCompared with sham group, the mRNA expression of Egr-1 and IL-1β, the levels of MPO and W/D were significantly increased in I/R group (P<0.05). The inflammatory responses of the lungs in I/R group were significantly severer than those in sham group. Compared with I/R group, the mRNA expression of Egr-1 and IL-1β, the levels of MPO and W/D in IPostC group were significantly decreased (P<0.05). The inflammatory responses of the lungs in IPostC group were also significantly attenuated.CONCLUSIONIschemic post-conditioning significantly reduces ischemic reperfusion injury of the lung by inhibiting the expression of Egr-1 and IL-1β.

Lung ischemia; Reperfusion injury; Post-conditioning; Early growth response factor-1; Interleukin-1β

R563

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.006

1000-4718(2011)01-0033-04

2010-07-16

2010-09-21

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(黔科合J字No.20092313)

△通訊作者 Tel：0756-5523329；E-mail:gary_wu5445@163.com