5-羥基癸酸鹽對慢性低氧大鼠肺動脈Kv1.5通道表達的影響*

李 秋， 張麗萍， 舒 鷹， 李云雷， 陳成水

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 浙江 溫州 325000)

5-羥基癸酸鹽對慢性低氧大鼠肺動脈Kv1.5通道表達的影響*

李 秋， 張麗萍， 舒 鷹， 李云雷， 陳成水△

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 浙江 溫州 325000)

目的以大鼠為研究對象，研究線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)的抑制劑5-羥基癸酸鹽(5-HD)對慢性低氧肺動脈高壓大鼠的影響及其潛在機制。方法24只SD雄性大鼠隨機分成對照組、低氧組、低氧+5-羥基癸酸鹽干預(yù)組，每組8只。將低氧組和5-HD干預(yù)組大鼠放入常壓低氧艙內(nèi)[O2(10.0%±0.3%)]以建立低氧肺動脈高壓模型。 4周后測定平均肺動脈壓(mPAP)及右心室與左心室及室間隔的重量比[RV/(LV+S)]，并采用RT-PCR及Western blotting技術(shù),分析各組肺動脈Kv1.5 mRNA及蛋白表達。結(jié)果(1) 慢性低氧組大鼠的mPAP及RV/(LV+S)顯著高于正常對照組(P<0.05)，5-HD干預(yù)組mPAP及RV/(LV+S)顯著低于低氧組，均P<0.05。(2) 低氧組Kv1.5通道m(xù)RNA及蛋白表達顯著低于正常組,5-HD組Kv1.5通道表達顯著高于低氧組, 均P<0.05。結(jié)論mitoKATP通道的抑制劑5-HD通過降低mPAP及RV/(LV+S),在慢性低氧肺動脈高壓中起保護作用。mitoKATP通道的抑制及Kv1.5通道表達的上調(diào)可能與該保護作用有關(guān)。

5-羥基癸酸鹽; Kv1.5通道; 線粒體ATP敏感性鉀通道; 大鼠

低氧刺激后，肺循環(huán)發(fā)生低氧性肺血管收縮反應(yīng)(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)，是肺血管獨有的生理現(xiàn)象。雖然這將有利于血液進入灌注好的肺血管、維持通氣血流比平衡。但是，持續(xù)HPV會導(dǎo)致肺泡長期缺氧，從而引起肺血管重構(gòu)、肺動脈高壓最終因右心衰致死亡率增加。近年來線粒體ATP 敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive K channe1,mitoKATP)在低氧肺動脈高壓中的作用已被逐漸認識。研究表明mitoKATP參與并影響了低氧肺動脈高壓的發(fā)生與發(fā)展[1]。另有實驗證明該通道參與許多與氧相關(guān)的生物過程，如mitoKATP開放劑在缺血缺氧性心肌病的預(yù)處理中對心肌細胞起保護作用[2,3]并在缺血性腦病預(yù)處理中起到相同的作用[4]。

低氧情況下鉀通道電流下降，膜去極化。持續(xù)膜去極化開放電壓依賴性鈣通道，細胞內(nèi)[Ca2+]升高，肺血管收縮，肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)增生、重構(gòu)，形成肺動脈高壓。近來研究表明在肺動脈高壓中，電壓門控鉀通道(voltage-gate K+，Kv)功能的失調(diào)，尤其是Kv1.5的表達及功能失調(diào)，是肺動脈高壓的基本特征[5-9]。已有實驗證明mitoKATP的特異性抑制劑5-羥基癸酸鹽(5-hydroxydecanoate，5-HD)能促進24 h低氧條件下培養(yǎng)的人肺動脈平滑肌細胞凋亡，減少增殖，且在低氧條件下上調(diào)Kv1.5通道的電流及蛋白的表達[1]。眾所周知生物體內(nèi)具有相互作用的細胞因子及復(fù)雜體液系統(tǒng)，然而既往研究僅限于環(huán)境比較單一的體外。且mitoKATP通道的特異性抑制劑5-HD是否能夠逆轉(zhuǎn)慢性低氧性肺動脈高壓(chronic hypoxic pulmonary artery hypertension ，CHPAH)大鼠及其結(jié)構(gòu)重建呢？其機制又是如何?并無相關(guān)報道。本文擬在在體水平研究mitoKATP的抑制劑5-HD對CHPAH大鼠血流動力學(xué)的影響及其機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1實驗動物 雄性SD大鼠24只，體重200-300 g，清潔級，由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2試劑 5-HD購自Sigma,用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)溶解至所需濃度。Trizol試劑購自Invitrogen。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(A3500)及PCR試劑(M7122)均購自Promega。多克隆羊抗大鼠Kv1.5抗體和多克隆兔抗大鼠β-actin 抗體均購自Santa Cruz。辣根酶標記兔抗山羊IgG (H+L)Ⅱ抗和山羊抗兔IgG(H+L)Ⅱ抗均購自北京中衫生物技術(shù)公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Pierce。提取蛋白RIPA強裂解液購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，其余均為市售分析純。

2方法

2.1動物模型的制備 用隨機數(shù)字表將動物隨機分為正常組、缺氧組、缺氧組5-HD干預(yù)組，每組各8只。將缺氧組、缺氧+5-HD干預(yù)組置入開孔式常壓低氧的艙內(nèi)，測氧儀連續(xù)監(jiān)測，充入N2使O2維持在(10.0±0.3)%,CO2維持在<3.0%，以無水氯化鈣吸收水蒸氣，鈉石灰吸收CO2，每天低氧8 h，每周6 d，連續(xù)4周。缺氧+5-HD組在缺氧1周后，每天在低O2前予以皮下注射5-HD(5 mg/kg),低氧組則每天予相同體積PBS皮下注射，連續(xù)3周，正常組置同室正常氧濃度環(huán)境飼養(yǎng)。

2.2大鼠平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)及右心室重量比[the ratio of right ventricle weight to left ventricle with septum weight，RV/(LV+S)]的測定 4周后，用5%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，行頸正中切口，采用右心導(dǎo)管法[10]測定大鼠肺動脈壓力。將聚乙烯塑料導(dǎo)管(OD 1.1 mm,ID 0.9 mm,溫州醫(yī)學(xué)院病理生理教研室提供)從右側(cè)頸外靜脈按順序插入右房、右室和肺動脈和導(dǎo)管另一端與MEDLAB 數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)相連，測mPAP。放血處死大鼠后，迅速取出大鼠心肺，剪去心臟中心房組織，沿心間隔邊緣分離出右心室(right ventricle,RV)及左心室和室間隔(left ventricle+septum,LV+S),用濾紙吸干水分后稱重RV及LV+S，計算右心室肥厚指數(shù)即RV/(LV+S)的重量比(%)。

2.3RT-PCR方法測定Kv1.5 mRNA的表達 低溫下迅速分離肺組織中的肺動脈，右側(cè)肺動脈用于RT-PCR,置于液氮中保存。取各組大鼠肺動脈先液氮研磨，以Trizol試劑按說明提取總RNA。取總RNA 10 μL,加入0.2 mL EP管，70 ℃10 min，離心15 s，置冰上。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，以oligo為引物，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶建立50 μL反應(yīng)體系，42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。取逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA 5 μL為PCR模板，按PCR試劑盒說明建立25 μL反應(yīng)體系。β-actin:正義鏈引物 5’-GTC CCT GTA TGC CTC TGG-3’，反義鏈引物 5’-GTC TTT ACG GAT GTC AACG-3’，退火溫度54 ℃，產(chǎn)物457 bp；Kv1.5:正義鏈引物 5’-CCA GCG AGT CCT CAT AAA CA-3’，反義鏈引物 5’-CAC TAT GGC GAT GGC TCTT-3’退火溫度56 ℃。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min，產(chǎn)物長度409 bp。此后，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓80 V,時間1 h，再用凝膠成像系統(tǒng)檢測目的條帶，Gelpro32軟件測定條帶A值，以Kv1.5目的條帶與β-actin目的條帶的A值之比分別作為Kv1.5 mRNA的相對表達量。

2.4Western boltting方法測定Kv1.5蛋白的表達 低溫下迅速分離肺組織中的肺動脈，左側(cè)肺動脈置于液氮中保存。取各組大鼠肺動脈，用強RIPA裂解液(江蘇碧云天生物技術(shù)公司)，其中按體積比1∶100加入PMSF(江蘇碧云天生物技術(shù)公司)裂解肺動脈，提取總蛋白，BCA法(Pierce)測定蛋白濃度。每組取等量75 μg蛋白，在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離細胞總蛋白。目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉(BD)室溫封閉1 h后,Ⅰ抗(多克隆羊抗大鼠Kv1.5，Santa Cruz))孵育4 ℃過夜，Ⅰ抗稀釋度為1∶200，再用Ⅱ抗(辣根酶標記兔抗山羊IgG，1∶5 000，北京中山生物技術(shù)公司)孵育室溫2 h 30 min，最后用TBST緩沖液洗膜10 min 3次，用ECL(Pierce)顯影。Gel-Pro 32軟件測定條帶A值，以Kv1.5目的條帶與β-actin目的條帶的A值之比作為Kv1.5 蛋白的相對表達量。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1各組mPAP和RV/(LV+S)的比較

低氧組與正常對照組比較mPAP和RV/(LV+S)升高(均P<0.05), 表明肺動脈高壓形成,右室肥大,肺動脈高壓動物模型復(fù)制成功。低氧+5-HD組與低氧組比mPAP和RV/(LV+S)均顯著下調(diào)(均P<0.05),表明5-HD能顯著抑制低氧引起的肺動脈高壓和右心室肥大，見表1。

表1各組mPAP、RV/(LV+S)的變化

GroupmPAP(mmHg)RV/(LV+S)(%)Normal10.02±0.6028.53±1.87Hypoxia+PBS15.92±1.27△34.27±1.20△Hypoxia+5-HD12.78±1.72#31.53±1.20#

△P<0.05vsnormal ;#P<0.05vshypoxia+PBS.

2RT-PCR檢測各組Kv1.5mRNA表達

Kv1.5通道產(chǎn)物條帶為409 bp，β-actin產(chǎn)物條帶為457 bp。 結(jié)果表明，慢性低氧可明顯降低肺動脈Kv1.5 mRNA表達(P<0.05)，5-HD干預(yù)后PAMSCs Kv1.5 mRNA表達較單純低氧組增加(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Effect of hypoxia and 5-HD on Kv1.5 mRNA expression in pulmonary arteries. A: agarose gel electrophoresis of PCR products amplified with the primers indicated above, using pulmonary arteries in different groups.β-actin mRNA was used as a control; B: Bars show the relative expression levels of Kv1.5 (absorbance of Kv1.5 mRNA normalized against β-actin mRNA).*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vshypoxia+PBS group.

圖15-HD對各組大鼠肺動脈Kv1.5mRNA表達的影響

3Westernboltting法檢測各組Kv1.5蛋白的表達

結(jié)果顯示，慢性低氧組比正常組顯著下調(diào)肺動脈Kv1.5蛋白的表達(P<0.05)，低氧+5-HD組一定程度逆轉(zhuǎn)了單純低氧對Kv1.5蛋白的抑制，使Kv1.5蛋白的表達顯著上調(diào)，兩者差異顯著(P<0.05), 見圖2。

討 論

低氧肺動脈高壓是一種嚴重的疾病。肺血管的收縮和重建在肺血管阻力增高中起到主要作用。既往研究表明肺動脈平滑肌中存在Kv且其參與低氧肺血管收縮的過程[6]。另發(fā)現(xiàn)在肺動脈高壓人群及慢性低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠中，肺動脈平滑肌上的Kv通道下調(diào)[7-9]，使得Kv通道成為一個極具潛力的治療靶點，增加Kv的活性及表達將有助于低氧肺動脈高壓的治療。迄今為止，發(fā)現(xiàn)Kv通道有許多不同的亞型，各種亞型對低氧的敏感度有所不同。研究發(fā)現(xiàn)，慢性低氧下調(diào)肺動脈平滑肌細胞的Kv通道的表達，包括Kv1.1、Kv1.2、Kv1.4、Kv1.5、 Kv2.1、Kv4.3和Kv9.3[11]。在我們的研究中主要針對的是Kv1.5，因有大量的實驗表明在低氧肺動脈高壓中Kv1.5的表達下調(diào)及功能障礙，已成為肺動脈高壓的基本特征之一[7-9]，另大多人傾向Kv1.5可能是最主要的氧敏感亞型[8,12]。

Figure 2. Effects of hypoxia and 5-HD on Kv1.5 protein expression in pulmonary arteries detected by Western blotting. A: Western blotting of pulmonary arteries from different groups. β-actin protein expression was used as a control; B: bars show the relative expression levels of Kv1.5 (absorbance of Kv1.5 normalized against β-actin expression).*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vshypoxia+PBS group.

圖25-HD對慢性低氧大鼠肺動脈Kv1.5蛋白表達的影響

線粒體是細胞內(nèi)一種重要的細胞器，具有復(fù)雜的亞微結(jié)構(gòu)和功能轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，通過氧化磷酸化為細胞生命活動提供能量。mitoKATP是1991在線粒體內(nèi)膜的單通道記錄中首次發(fā)現(xiàn)的[13]。后續(xù)的研究表明mitoKATP對低氧極為敏感,在生理狀態(tài)下,細胞內(nèi)生理濃度的ATP存在, mitoKATP基本處于關(guān)閉狀態(tài)。在機體缺氧情況下, mitoKATP通道開放,K+內(nèi)流,線粒體膜去極化,從而影響細胞氧自由基、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶、細胞色素C的生成和分配及多種蛋白激酶或轉(zhuǎn)錄因子的活性,抑制細胞凋亡,從而對缺血再灌注組織(如心肌、神經(jīng)元等)發(fā)揮保護作用[14-16]。同時研究發(fā)現(xiàn)mitoKATP通道開放劑diazoxide抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體凋亡通路的激活，而mitoKATP通道的抑制劑5-HD則逆轉(zhuǎn)了diazoxide的抗凋亡的作用[17]。迄今為止，關(guān)于mitoKATP通道在低氧肺動脈重建的作用闡述并不多。

有研究表明，在離體人肺動脈平滑肌24 h缺氧下mitoKATP通道開放，線粒體膜電位發(fā)生去極化，從而引起Kv1.5通道m(xù)RNA及蛋白表達明顯降低，增加其增殖，減少凋亡。而mitoKATP通道阻斷劑5-HD 能夠減弱缺氧引起的上述效應(yīng)[3]。然而既往研究僅局限于體外，且短期缺氧條件下體外培養(yǎng)的細胞可能無法準確反映完整的動物體內(nèi)慢性缺氧mitoKATP通道的作用，因低氧的持續(xù)時間及程度、各種細胞因子、循環(huán)因子及復(fù)雜的體液系統(tǒng)等都可能對其產(chǎn)生影響。

本實驗成功建立低氧性肺動脈高壓模型。低氧組的mPAP及RV/(LV+S)與正常對照組相比明顯升高。另外，大鼠在低氧條件下，Kv1.5 mRNA及蛋白表達的下降與既往研究結(jié)果一致[5-9，11，12]。大鼠慢性缺氧1周后，每天5-HD(5 mg/kg/d)干預(yù)，連續(xù)3周，來評估其對低氧肺動脈高壓的影響。結(jié)果顯示 mitoKATP抑制劑5-HD逆轉(zhuǎn)了CHPAH大鼠的mPAP及RV/(LV+S)的升高，且肺動脈中Kv1.5通道的mRNA及蛋白表達較單純低氧組有所上調(diào)。據(jù)此，我們可推測低氧性肺動脈高壓形成與mitoKATP通道密切相關(guān)。

關(guān)于Kv通道的表達調(diào)控所知甚少。慢性低氧時肺動脈上Kv1.5通道的下調(diào)機制并不明確，但相關(guān)研究表明其與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控有關(guān)，如低氧誘導(dǎo)因子-1參與上調(diào)包括血管內(nèi)皮因子、內(nèi)皮素-1、一氧化氮合酶-2的基因等[18]。盡管我們的結(jié)果顯示了mitoKATP抑制劑5-HD可上調(diào)Kv1.5通道的表達，但并不清楚其是否直接增加基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達。其可能由氧自由基增多，PKC激活、低氧誘導(dǎo)因子-1等介導(dǎo)。通過我們的實驗至少可以推測5-HD干預(yù)后Kv1.5通道表達的改變可能是其逆轉(zhuǎn)肺動脈高壓的機制之一。同時我們發(fā)現(xiàn)5-HD雖然能通過抑制線粒體膜電位，降低肺動脈壓力和上調(diào)Kv1.5表達，但其并不能夠完全逆轉(zhuǎn)。因此，我們推測mitoKATP通道并不是低氧的唯一作用靶點。

此外我們的實驗表明Kv通道表達下調(diào)可能與低氧肺動脈高壓形成的病因相關(guān)。大量研究表明，在低氧肺動脈高壓中，肺動脈平滑肌中Kv1.5通道的表達下降[4-9，11，12]。但是關(guān)于Kv通道表達的改變是與疾病的病因相關(guān)或只是繼發(fā)性改變?nèi)圆幻鞔_。我們的實驗表明5-HD通過下調(diào)Kv1.5的表達逆轉(zhuǎn)低氧肺動脈高壓，支持Kv通道在該低氧肺動脈高壓模型的致病機制中起到一定作用。

迄今為止，仍沒有特異性Kv通道開放劑，5-HD能夠在低氧時逆轉(zhuǎn)低氧肺動脈高壓大鼠Kv通道的表達，且研究表明在正常情況下，5-HD對離體培養(yǎng)人肺動脈平滑肌中Kv通道的功能及表達無影響[19]。因此我們認為通過mitoKATP通道來調(diào)控Kv通道在治療肺動脈高壓中極具潛力。

當然，本實驗有一定的局限性，如未對Kv通道的功能方面進行研究。另外，本實驗取材是肺動脈主干,所得出結(jié)論是否適用于肺小阻力血管。這些方面有待于今后進一步研究。

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Effectsof5-hydroxydecanoateonKv1.5expressioninpulmonaryarteriesofchronichypoxicrats

LI Qiu, ZHANG Li-ping, SHU Ying, LI Yun-lei, CHEN Cheng-shui

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:chenchengshui@gmail.com)

AIM: To investigate the effect of mitochondrial ATP-sensitive potassium channel(mitoKATP) inhibitor 5-hydroxydecanoate (5-HD) on chronic hypoxic pulmonary artery hypertension (CHPAH) in rats.METHODSTwenty-four male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups:control group, hypoxia group and hypoxia+5-HD group. To establish an animal model of CHPAH, the rats in hypoxia group and hypoxia+5-HD group were placed into a hypoxic and normobaric chamber [O2(10.0±0.3)%] for 4 weeks (8 h a day, 6 days a week). The mean pulmonary arterial pressure (mPAP) and the ratio of right ventricle weight to left ventricle with septum weight [RV/(LV+S)] were measured. Western blotting and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) were performed to analyze the protein and mRNA levels of Kv1.5 in the pulmonary artery,respectively.RESULTSThe mPAP and RV/(LV+S) were much higher in hypoxia group than those in control group, while those in hypoxia+5-HD group were decreased as compared to hypoxia group. The protein and mRNA levels of Kv1.5 in hypoxic group were significantly lower than those in control group, and this decrease was partly reversed by 5-HD.CONCLUSION5-HD may exert a protective effect on CHPAH by decreasing mPAP and RV/ (LV+S). Inhibiting mitoKATPand stimulating Kv1.5 expression by 5-HD may contribute to the mechanism of this effect.

5-Hydroxydecanoate; Kv1.5 channel; Mitochondrial ATP-sensitive potassium channels; Rats

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.004

1000-4718(2011)01-0022-05

2010-07-08

2010-10-11

浙江省自然科學(xué)基金資助項目(No.Z2080988)

△通訊作者 Tel：0577-88069355; E-mail: chenchengshui@gmail.com