CoREST基因在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中的表達(dá)、分布和意義*

肖 軍， 趙贊棟， 史占軍△， 梁錦前， 吳志宏， 邱貴興

(1南方醫(yī)院關(guān)節(jié)骨病外科， 廣東 廣州 510515；2北京協(xié)和醫(yī)院骨科， 北京 100730)

CoREST基因在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中的表達(dá)、分布和意義*

肖 軍1， 趙贊棟1， 史占軍1△， 梁錦前2， 吳志宏2， 邱貴興2

(1南方醫(yī)院關(guān)節(jié)骨病外科， 廣東 廣州 510515；2北京協(xié)和醫(yī)院骨科， 北京 100730)

目的觀察RE-1元件輔助沉默因子(CoREST)基因在正常和骨關(guān)節(jié)炎(OA)膝關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達(dá)和分布，分析CoREST基因表達(dá)下調(diào)對OA的病理意義。方法取材膝關(guān)節(jié)正常(n=10)和OA(n=12)軟骨組織，提取軟骨細(xì)胞并包埋制備切片，應(yīng)用real-time PCR技術(shù)對比CoREST基因在正常和OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)水平的總體差異，應(yīng)用原位雜交技術(shù)觀察CoREST基因在正常/OA軟骨表、中、深各層組織中的表達(dá)和分布的特點(diǎn)。結(jié)果CoREST基因在OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著降低64.6%(P<0.01)。CoREST基因廣泛表達(dá)于正常軟骨組織的表層、中層和深層，以中層表達(dá)最為顯著，其次為深層和表層。在OA軟骨組織中，CoREST基因在淺層細(xì)胞簇部分細(xì)胞中表達(dá)水平升高，在深層潮線狀細(xì)胞柱中表達(dá)水平普遍降低。結(jié)論CoREST基因在正常和OA軟骨組織細(xì)胞中的差異表達(dá)和分布與文獻(xiàn)報(bào)道的X型膠原基因的組織學(xué)表達(dá)一致。結(jié)合前期研究成果，我們認(rèn)為CoREST的生物功能可能與OA軟骨細(xì)胞的終末分化相關(guān)。

RE-1元件輔助沉默因子； 骨關(guān)節(jié)炎； 軟骨細(xì)胞； 原位雜交

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種以軟骨退變、磨損為病理表現(xiàn)的疾病[1]。軟骨細(xì)胞終末分化，導(dǎo)致合成/分解代謝負(fù)平衡，甚至凋亡，是OA軟骨缺損修復(fù)困難和OA進(jìn)展的關(guān)鍵原因之一[2]。我們前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)OA軟骨細(xì)胞表達(dá)RE-1元件輔助沉默因子[RE-1 silencing transcription factor (REST) corepressor, CoREST]的水平較正常軟骨細(xì)胞顯著降低，誘發(fā)軟骨細(xì)胞表型基因的表達(dá)呈現(xiàn)特征性變化，提示CoREST是OA軟骨細(xì)胞終末分化的始動(dòng)因子或軟骨細(xì)胞合成代謝的調(diào)節(jié)因子[3]。本文旨在通過組織學(xué)切片進(jìn)一步觀察CoREST基因在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中的表達(dá)和分布特點(diǎn)，了解CoREST在OA發(fā)生和發(fā)展過程中的病理意義。

材 料 和 方 法

1資料及分組

OA膝關(guān)節(jié)軟骨組織取材自接受膝關(guān)節(jié)表面置換的OA患者[n=12，男性2人，女性10人，平均年齡62.7歲(53-72歲)]。OA診斷依據(jù)美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)2001年版指南。正常軟骨組織取材于遺體捐獻(xiàn)患者[n=10，男性2人，女性8人，平均年齡65.1歲(60-71歲)]，排除膝關(guān)節(jié)疾病病史。軟骨標(biāo)本取材均經(jīng)過患者或家屬知情同意。

2軟骨細(xì)胞總RNA的提取和鑒定

液氮速凍后，稱取約100 mg軟骨組織，研磨成粉末。加入含β-巰基乙醇的RLC緩沖液，應(yīng)用RNeasy Fibrous Tissue Mini kit(Qiagen)提取組織總RNA。操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。最后步驟采用13 μL DEPC H2O洗脫。所獲RNA溶液測量A280/260比值確認(rèn)純度合格后，剩余約11 μL RNA溶液直接作為模板進(jìn)行第1鏈cDNA的合成。

3第1鏈cDNA的合成

反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA采用ReverTra Ace -α-TM kit (Toyobo)。反應(yīng)體系構(gòu)成為：RNA溶液11 μL，oligo(dT) 1 μL，5×緩沖液 4 μL，10 mmol/L dNTP混合物 2 uL，ReverTra Ace(1×108U/L)1 μL，RNA酶抑制劑1 μL。反應(yīng)條件為：30 ℃ 10 min；42 ℃ 20 min；95 ℃ 5 min；4 ℃終止反應(yīng)。

4Real-timePCR

CoREST和內(nèi)參照GAPDH引物(表1)通過Roche公司在線程序Universal ProbeLibrary for Human(https://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/upl/acenter.jsp?id=030000)設(shè)計(jì)。引物特異性通過Blast程序(NCBI GenBank)驗(yàn)證。

表1 Real-time PCR引物

Real-time PCR試劑選用QuantiTectTMSYBR? Green PCR (Qiagen)。反應(yīng)條件：94 ℃ 60 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)40次。反應(yīng)體系構(gòu)成：cDNA模板2 μL、SYBR master Mix 10 μL、上下游引物(300 nmol/L)各1 μL、DEPC H2O 6 μL。PCR反應(yīng)首先采用Roter-Gene 3000(Roche)進(jìn)行，通過雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法比較CoREST和GAPDH引物的擴(kuò)增效率。確認(rèn)擴(kuò)增效率差異僅0.04后，改用Applied Biosystems 7500系統(tǒng)(ABI)對比CoREST基因表達(dá)在正常和OA組軟骨細(xì)胞之間的差異，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。組間差異應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算。

5探針的合成與標(biāo)記

CoRESTmRNA寡核苷酸探針應(yīng)用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)，序列為5′-CGAG GACTAAAACT AGTGTGATGG ATCGCCATGC CCGGAAACAA AAACGGGAGC-3′。序列特異性經(jīng)過BLAST(同前)驗(yàn)證。探針采用地高辛5′端標(biāo)記，由Invitrogen合成。

6軟骨組織原位雜交

軟骨組織變性、洗滌后直接包埋石蠟，切片厚度4 μm, 貼片后經(jīng)72 ℃烘烤3 h。二甲苯、乙醇梯度入水，蛋白酶K (100 mg/L ) 37 ℃消化15 min。4% 多聚甲醛固定10 min，2×SSC、三蒸水洗滌后逐級(jí)乙醇脫水。滴加預(yù)雜液，42 ℃預(yù)雜2 h后，滴加40-60 μL變性的雜交液(探針濃度2 mg/L), 45 ℃雜交過夜。室溫下2×SSC洗滌5 min 2次，0.5×SSC洗滌15 min 2次，0.2×SSC洗滌15 min 2次，洗去非特異性結(jié)合。滴加封閉液，37 ℃孵育30 min，滴加1∶100稀釋的兔抗地高辛-BSA抗體。37 ℃孵育60 min，0.1 mol/L PBS洗滌5 min×4次。添加DAB顯色45 s，充分水洗后蘇木素復(fù)染。封片后顯微鏡下觀察原位雜交結(jié)果，圖像資料導(dǎo)入Image Pro 6.0軟件進(jìn)行分析。CoREST基因陽性表達(dá)細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)為：細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色的顆?；虬邏K。

7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

CoREST基因表達(dá)在正常/OA軟骨細(xì)胞間的差異和CoREST基因在軟骨組織各層表達(dá)水平的差異均采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行組間對比統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié) 果

1CoREST基因在正常軟骨和OA軟骨細(xì)胞中的差異表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示OA軟骨細(xì)胞中CoREST的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。OA軟骨細(xì)胞中CoREST表達(dá)水平相比正常軟骨細(xì)胞平均降低64.6%，P<0.01，差異顯著，見圖1。

2CoREST基因在軟骨組織中的表達(dá)和分布

CoREST基因在OA軟骨組織中廣泛表達(dá)于軟骨各層(表層、中層和深層)，其中，中層軟骨細(xì)胞中的CoREST表達(dá)量最高，細(xì)胞胞漿普遍呈棕黃色染色。深層細(xì)胞潮線內(nèi)軟骨細(xì)胞CoREST表達(dá)量稍少于中層，表現(xiàn)為部分軟骨細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)淺黃色淡染。在表層軟骨細(xì)胞中，CoREST表達(dá)量最少，部分細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)空泡樣改變，CoREST表達(dá)缺如。CoREST在正常軟骨組織細(xì)胞中的mRNA的表達(dá)量總體呈現(xiàn)：中層>深層>表層趨勢，見圖2A、B。

OA軟骨表現(xiàn)為表層組織不同程度磨損、裂縫或纖維化。在磨損或裂縫的表面下，淺層軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)團(tuán)簇樣增生，而深層細(xì)胞量減少，潮線結(jié)構(gòu)趨于不明顯。在表層團(tuán)簇樣增生的細(xì)胞中，部分細(xì)胞呈現(xiàn)濃染的棕黃色胞漿，說明CoREST高表達(dá)。但是，這種表達(dá)并不均一，在同一細(xì)胞簇的部分其它細(xì)胞中，CoREST染色較弱甚至呈現(xiàn)陰性表達(dá)。在深層呈潮線排列的軟骨細(xì)胞中，CoREST染色陽性細(xì)胞呈零星分布，整體表達(dá)豐度明顯低于OA軟骨表層和正常軟骨,見圖3。

缺損灶周圍的軟骨區(qū)域，軟骨細(xì)胞雜亂增生，排列失去層次和規(guī)律，軟骨基質(zhì)呈現(xiàn)纖維化。在這些區(qū)域，CoREST基因在絕大部分軟骨細(xì)胞中表達(dá)缺如，細(xì)胞胞漿無陽性染色信號(hào)，見圖4A。在軟骨缺損灶底部，CoREST基因表達(dá)缺如，見圖4B。

圖1正常和OA軟骨組織細(xì)胞中CoREST基因表達(dá)水平對比

Figure 2.CoRESTgene expression in normal cartilage(×100).

圖2CoREST基因在正常軟骨組織中的表達(dá)

Figure 3.CoRESTgene expression in osteoarthritic cartilage(×100)

圖3CoREST基因在OA軟骨組織中的表達(dá)

Figure 4.CoRESTgene expression in the region around the cartilage defect (4A,×100;4B,×200).

圖4CoREST基因在OA軟骨缺損灶周圍組織中的表達(dá)

討 論

CoREST的經(jīng)典定義是一種神經(jīng)元表型調(diào)控因子，它以CoREST/ REST復(fù)合體的作用模式，發(fā)揮對神經(jīng)元分化的調(diào)控[4]。在非神經(jīng)元細(xì)胞種屬中，CoREST被認(rèn)為通過抑制神經(jīng)元表型基因的表達(dá)，參與維持這些細(xì)胞表型的特異性和穩(wěn)定性[5]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)CoREST參與了對OA軟骨細(xì)胞表型的調(diào)控。CoREST在OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞正常分化表型II型膠原和aggrecan表達(dá)水平下降，而終末分化表型X型膠原表達(dá)水平升高，提示CoREST是OA軟骨細(xì)胞終末分化的始動(dòng)因子，或軟骨細(xì)胞合成代謝的調(diào)控因子[3]。

本文在基因水平上驗(yàn)證CoREST在OA軟骨細(xì)胞中的差異表達(dá)，并觀察CoREST基因在不同程度病損的OA軟骨組織，以及軟骨組織不同區(qū)域表達(dá)水平的差異，旨在通過觀察CoREST與軟骨組織細(xì)胞區(qū)域性病理變化之間的相關(guān)性，提供CoREST參與調(diào)控OA軟骨細(xì)胞病理改變的線索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果首先證實(shí)CoREST基因表達(dá)水平在OA軟骨細(xì)胞中顯著下降，幅度達(dá)到64.6%。

原位雜交發(fā)現(xiàn)CoREST在OA軟骨組織中的表達(dá)并非整體降低。CoREST基因廣泛表達(dá)于正常軟骨組織的表層、中層和深層，其中，中層軟骨細(xì)胞中CoREST表達(dá)豐度最高，深層相對較低，表層表達(dá)相對較少。在OA軟骨中，磨損的軟骨表層被增生的細(xì)胞團(tuán)簇所替代，同時(shí)，深層潮線狀排列的細(xì)胞數(shù)量較正常減少。雖然CoREST在OA軟骨的表達(dá)總體下調(diào)，但在OA軟骨組織淺層增生的細(xì)胞團(tuán)簇中，大部分細(xì)胞卻呈現(xiàn)CoREST基因的高表達(dá)，雖然這種表達(dá)并不均一，團(tuán)簇內(nèi)部分細(xì)胞表達(dá)CoREST甚至缺如。在OA軟骨深層潮線狀排列的細(xì)胞中，大部分細(xì)胞均表現(xiàn)為CoREST陰性表達(dá)或低表達(dá)。在纖維化嚴(yán)重的區(qū)域和OA軟骨缺損區(qū)域，CoREST表達(dá)水平才整體下降。

可見，CoREST基因表達(dá)下降主要集中在OA軟骨組織的深層細(xì)胞。結(jié)合前期的研究成果，我們分析CoREST在組織深層OA軟骨細(xì)胞的下調(diào)表達(dá)將誘導(dǎo)深層軟骨細(xì)胞上調(diào)表達(dá)X型膠原基因，同時(shí)抑制局部II型膠原和蛋白多糖的合成。該分析結(jié)果與Aigner等[6]關(guān)于X型膠原基因在OA軟骨組織中的分布相符-通過原位雜交技術(shù)，Aigner證實(shí)X型膠原基因主要表達(dá)于OA軟骨組織的深層細(xì)胞，而在表層增生的細(xì)胞團(tuán)簇內(nèi)中表達(dá)較少。另一方面，Nelson等[7]和Pfander等[8]分別通過免疫組織化學(xué)技術(shù)，證實(shí)OA軟骨細(xì)胞上調(diào)表達(dá)II型膠原，主要集中于組織深層的軟骨細(xì)胞，這種現(xiàn)象不能用我們所觀察到的CoREST在OA軟骨組織各層之間的差異表達(dá)來解釋。

綜上所述，本文原位雜交結(jié)果進(jìn)一步支持將CoREST的生物功能與OA軟骨細(xì)胞X型膠原基因表達(dá)的調(diào)控以及軟骨細(xì)胞的終末分化的調(diào)控相關(guān)聯(lián)。而軟骨細(xì)胞II型膠原等產(chǎn)物的合成代謝可能受到其它調(diào)控因子的綜合影響，不能以CoREST調(diào)控“一元論”解釋。CoREST調(diào)控軟骨細(xì)胞終末分化的生物功能和分子通路仍有待深入研究。

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DifferentialexpressionanddistributionofCoRESTinosteoarthriticcartilage

XIAO Jun1, ZHAO Zan-dong1, SHI Zhan-jun1, LIANG Jin-qian2, WU Zhi-hong2, QIU Gui-xing2

(1DepartmentofOrthopaedics,NanfangHospital,Guangzhou510515,China;2DepartmentofOrthopaedicsandTraumatology,PekingUnionMedicalCollegeHospital,Beijing100730,China.E-mail:zhanjunshi@yahoo.com.cn)

AIM: To analyze the role of RE-1 silencing transcription factor corepressor (CoREST) in the pathogenesis of osteoarthritis (OA) by observing the differential expression and distribution ofCoRESTgene in the normal and osteoarthritic knee cartilages.METHODSThe samples of knee cartilage were obtained from the normal donors (n=10) and the patients undergoing total knee arthroplasty with the diagnosis of OA (n=12). The chondrocytes were isolated and paraffin sections were prepared. The expression levels ofCoRESTgene were determined in the normal and osteoarthritic chondrocytes by real-time PCR. The mRNA expression and distribution ofCoRESTin the individual layers, including the superficial, middle and deep layer of the normal and OA cartilage, were observed by the method ofinsituhybridization.RESULTSCompared with normal chondrocytes,CoRESTgene expression was down-regulated by 64.6% (P<0.01) in OA chondrocytes.CoRESTmRNA was generally expressed in all the superficial, middle and deep layers of the normal cartilage, in which the highest was in the middle layer and then in the deep and superficial layers. In OA cartilage, CoREST mRNA expression was up-regulated dominantly in the cell clusters of the superficial layer, whereas down-regulated in the cell columns of the deep layer.CONCLUSIONThe expression and distribution ofCoRESTgene between normal and OA chondrocytes are similar to those of the reported type X collagen. Based on the achievements of our previous study, we consider that the biological function of CoREST is correlated with the terminal differentiation of OA chondrocytes.

RE-1 silencing transcription factor corepressor; Osteoarthritis; Chondrocytes;Insituhybridization

R68

A

1000-4718(2011)03-0585-04

2010-08-16

2010-11-11

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院院長基金資助項(xiàng)目(No.2008C009)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(No.A2010362)

△通訊作者 Tel: 020-61641722; E-mail: zhanjunshi@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.032