眼皮膚白化病研究的新途徑及TYR基因2種新突變的分析*

廖沛熙， 李 卓， 逄 婷， 蔣瑋瑩△， 李洪義△

(1中山大學光華口腔醫學院，廣東 廣州 510080；2香港科技大學理學院生命科學部，中國香港 九龍；3中山大學中山醫學院醫學遺傳學教研室，廣東 廣州 510080)

眼皮膚白化病研究的新途徑及TYR基因2種新突變的分析*

廖沛熙1， 李 卓2， 逄 婷3， 蔣瑋瑩3△， 李洪義3△

(1中山大學光華口腔醫學院，廣東 廣州 510080；2香港科技大學理學院生命科學部，中國香港 九龍；3中山大學中山醫學院醫學遺傳學教研室，廣東 廣州 510080)

目的探討自眼皮膚白化病(OCA)患者毛發提取DNA對OCA分型研究的可行性及TYR基因2種新突變的致病性。方法應用毛發壓片鏡檢，PCR擴增毛發DNA中OCA相關基因各外顯子、外顯子-內含子交界區及啟動子區，直接以序列測定技術分析患者基因突變，明確患者的基因型。對于發現的新突變，采用突變等位基因頻率等方法對其進行深入研究。結果3個家系的先證者均為1型OCA。家系1的先證者為c.715C>T (p.R239W)和c.929insC (p.P310PfsX7)突變的復合雜合子；家系2的先證者為c.896G>A (p.R299H)的純合子；家系3的先證者為c.1362+3A>T和c.650G>C (p.R217P)突變的復合雜合子。其中，c.1362+3A>T和c.650G>C (p.R217P)突變為至今尚未報道的新突變，通過對新突變進行分析，推測其極可能為病理性新突變。結論本實驗成功證實從毛發中提取DNA的方法對OCA分型研究的可行性，同時確定了2種致病性新突變，為今后OCA研究開拓了新的思路和途徑。

眼皮膚白化病； 毛發； 基因突變

眼皮膚白化病(oculocutaneous albinism, OCA)是一組以皮膚、毛發、眼黑色素生物合成障礙以及眼和皮膚功能異常為主要臨床表現的疾病[1]。依據致病基因的不同，目前將OCA分為4型[2-5]，分別是酪氨酸酶基因(tyrosinase,TYR)突變導致的OCA1、P蛋白基因(P)突變導致的OCA2、酪氨酸酶相關蛋白1基因(tyrosinase-related protein 1,TYRP1)突變引起的OCA3和溶質載體家族45成員2基因(solute carrier family 45, member 2,SLC45A2)突變所致的OCA4。各型OCA均呈常染色體隱性遺傳，具有明顯的危害。近年來國內外針對OCA的診斷方法主要是從患者外周血液標本中獲取DNA進行分析[6-8]，然而此方法存在創傷性、不安全性以及運輸儲藏不方便等不足之處。本課題組擬通過從毛球中提取DNA的方法，將毛發應用于眼皮膚白化病的遺傳異質性研究中，對于眼皮膚白化病的臨床和基因診斷都具有很高的應用價值。

材 料 和 方 法

1材料

3個OCA家系。家系1，先證者，男，8歲，頭發白，皮膚白，虹膜淡灰色，瞳孔反光紅色，水平中速眼球震顫，無斜視，視力低下。家系2，先證者，女，12歲，頭發白，皮膚白，虹膜灰白色，瞳孔反光紅色，水平中速眼球震顫，輕度斜視，視力低下。家系3，先證者，女，30歲，頭發白，皮膚白，虹膜灰白色，瞳孔反光暗紅色，輕度斜視，水平低速眼球震顫，視力低下。3例先證者臨床診斷均為OCA1，其父母表型均正常且非近親婚配，見表1。收集3個OCA家系及50名正常人頭發各若干根。無水乙醇清洗、蒸餾水漂洗后，自然風干待用。

2方法

2.1研究策略 光學顯微鏡下分別壓片觀察正常人黑色毛發、正常人白色毛發及白化病患者毛發的毛球結構，拍攝典型形態，以便指導臨床診斷。根據臨床診斷分析患者毛發DNA的OCA相關基因是否存在突變，隨后檢測患者父母相應基因的特定位點，明確突變的親代來源，從而確定患者的OCA基因型。對于新發現的突變，采用突變等位基因頻率等方法對其進行深入研究。

2.2毛發基因組DNA提取 取3個OCA家系先證者及其父母毛發各5根，存放20-30 d后，每根毛發靠近毛根約0.5 cm將毛球部剪下，采用海基生物科技有限公司提供的毛發微量基因組DNA提取試劑盒(HaiGene,Cat.No:B0503)，按說明書操作提取毛發基因組DNA。

2.3PCR引物設計與合成 從UCSC Genome Bioinformatics數據庫(http://genome.ucsc.edu/)中提取TYR基因(NM_000372)、P基因(NM_000275)、TYRP1基因(NM_000550)和SLC45A2基因(NM_016180)相關序列作為標準序列，根據此序列自行設計特異性引物，擴增范圍包括基因全部外顯子、外顯子-內含子交界區以及啟動子區。全部引物由上海Invitrogen生物技術有限公司合成。本文涉及的引物序列、相應的擴展產物長度以及退火溫度均已列出，見表2。

2.4PCR反應 反應總體系為30 μL，內含Mg2+2.5 mmol/L，dNTP 2.5 mmol/L，Tag酶1.5 U，上、下游引物各0.17 μmol/L，10×硫酸銨緩沖液3 μL，DNA模板50 ng，超純水16.5 μL。 擴增條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃ 30 s，按照各自復性溫度(50-64 ℃)退火40 s，72 ℃ 50 s，32個循環后，72 ℃ 8 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察和記錄擴增結果。

2.5DNA序列測定 OCA相關基因各擴增片段直接測序；對檢出的DNA序列變異經雙向測序核實后，進一步對其父母相應片段進行序列測定，確定患者及其父母的基因型。純化和測序工作由上海Invitrogen生物技術有限公司完成。

2.6突變等位基因頻率法 對于研究中發現的新突變，通過對50名(100個等位基因)無白化病表型且無親緣關系的正常人進行新突變等位基因篩查，探討突變致病的可能性。

結 果

1毛發組織形態學觀察

光學顯微鏡下可觀察到正常人黑色毛發、白色毛發、白化病患者(家系1先證者)的毛球及毛干結構，且分別對上述三者5倍、10倍、20倍的成像圖進行分析。結果顯示，正常人黑色毛發可見明顯的毛球及毛干結構，如髓質、皮質、毛小皮等結構；正常人白色毛發可見毛球結構出現明顯的退化，髓質、皮質結構不清；白化病患者毛發可見毛球及毛干結構存在，可見髓質、皮質結構，但未見明顯黑色髓質及黑色素細胞，見圖1。

2家系1OCA1突變分析

家系1先證者毛發DNA的TYR基因第1和第2外顯子檢測到2種國際白化病數據庫已經報道的致病性突變，即c.715C>T (p.R239W)和c.929insC (p.P310PfsX7)，其它擴增片段未見異常。對其父母相應位點進行序列分析，發現父母分別為c.715C>T (p.R239W)和c.929insC (p.P310PfsX7)突變的雜合子，故可以肯定先證者為此兩種突變的復合雜合子，見圖2。

Figure 1. Morphological features of hair bulb tissues (a,×5; b,×10; c,×20). 1: black hair control group; 2: white hair control group; 3: OCA-patient hair group.

圖1各組毛發組織形態學改變

Figure 2. Hair DNA sequencing in family 1.

圖2家系1的毛發DNA測序結果

3家系2OCA1突變分析

家系2先證者毛發DNA的TYR基因第2外顯子檢測到1種國際白化病數據庫已經報道的純合性突變c.896G>A (p.R299H)，其它擴增片段未見異常，對其父母相應位點進行序列分析，發現父母分別為c.896G>A (p.R299H)突變的雜合子。故可以肯定先證者為此突變的純合子，見圖3。

Figure 3. Hair DNA sequencing in family 2.

圖3家系2成員及正常對照的毛發DNA測序結果

4家系3OCA1突變分析

家系3先證者毛發DNA的TYR基因第1和第4外顯子檢測到2種國際白化病數據庫未見報道的突變，即c.1362+3A>T和c.650G>C(p.R217P)，其它擴增片段未見異常，對其父母相應位點進行序列分析，發現父母分別為c.1362+3A>T和c.650G>C(p.R217P)突變的雜合子，對上述突變進行生物信息學等相關分析，其為致病性突變的可能性很大。對其弟弟進行上述突變位點的檢測，發現其弟弟的基因型與患者相同，均為c.1362+3A>T/c.650G>C(p.R217P)，見圖4。

Figure 4. Hair DNA sequencing in family 3.

圖4家系3的毛發DNA測序結果

5新突變c.1362+3A>T和c.650G>C(p.R217P)的分析

上述兩種新突變在50名(100個等位基因)無白化病表型且無親緣關系的正常人中進行篩查時，均未見上述突變。家系3先證者的同胞弟弟也是OCA患者(Ⅱ：2)具有與先證者相同的TYR基因型。c.1362+3位的堿基由A變為T后，破壞了5’端剪接體的結構，可能通過影響mRNA前體剪接的正常進行，改變了翻譯后酶蛋白長度，從而影響了酶的催化活性。R217P突變是由堿性親水性氨基酸(精氨酸)變為中性疏水性氨基酸(脯氨酸)，有研究表明R217位點的突變可引起OCA1A表型，亦可引起OCA1B表型[15]。

表1 本研究3個OCA家系先證者臨床表現及基因診斷

*Novel mutations.M:male;F:female.

表2 TYR基因PCR擴增引物

討 論

眼皮膚白化病具有較高的遺傳異質性和等位基因異質性，盡管各種分型OCA患者的皮膚、毛發和眼均具有低色素表型及相應的危害，但不同分型之間以及同型不同個體之間臨床表現依然交錯重疊、輕重不一，致使臨床上僅從癥狀和體征上難以確診患者的OCA分型，因而提取患者DNA、分析其基因異質性在優生遺傳咨詢和產前基因診斷上具有不可替代的作用。

毛發作為人體的皮膚附屬器之一，具有分布廣泛、易于獲取等特點。毛發可分為毛干、毛根和毛球3部分，其中毛球是由毛根和毛囊上皮鞘融合而成。毛球中的毛母質細胞是一種增殖活躍的干細胞，形成毛根和上皮鞘的細胞，故其中含有豐富的染色體等遺傳物質[9，10]。此外，毛發的黑素細胞主要存在于毛球的基底部，其合成分泌黑色素顆粒障礙正是引起毛發低色素表現的主要原因。通過光鏡觀察對比正常人黑色毛發、白色毛發及白化病患者毛發，我們發現白化病患者的毛發基本結構清晰存在，沒有發生明顯的退化表現，但在毛球部分不能看到明顯的黑色素細胞且毛發的髓質顏色較淺，這與白化病患者的臨床表現和發病機制相吻合。因此從毛球中提取分析DNA具有組織學上的基礎和可行性。

以往對OCA的研究材料多是抽取患者的外周血，但此方法存在不足之處：給患者身體帶來一些創傷，血液不便于遠途運輸；樣品獲取及提取DNA的過程中會發生一些實驗室安全事件等。自Bradifield等[11]首次從頭發中提取核酸以來，毛發已成為應用于法醫學的常用檢測材料之一[12]。但是，毛發應用于眼皮膚白化病的研究至今少有報道[13]，其取樣方便、快捷，病人痛苦少，近乎無創，存放時間長。這也符合現今醫療微創、便捷和準確的趨勢，對將來OCA診斷和研究方法的改進提供了新思路。

本研究對所發現的兩種OCA新突變c.1362+3A>T和c.650G>C(p.R217P)進行了突變分析，突變IVS4+3A>T通過影響mRNA的正常剪接，導致翻譯后酪蛋白長度改變，從而影響酪氨酸酶的催化活性。此外，有文獻報道[14,15]c.1362+4A>G和c.1362+5A>G為致病性突變，它們緊鄰c.1362+3位點并位于其后。對于c.650G>C(p.R217P)突變，據文獻報道，p.R217位點存在p.R217W、p.R217Q和p.R217S 3種突變[16]，都是堿性氨基酸變為中性氨基酸，但在各物種之間蛋白質比對中發現p.R217位點并不保守，說明該位點在酪氨酸酶結構和功能中發揮的作用并非特別重要，它們既可引起OCA1A表型，也可引起OCA1B表型，提示本文發現的c.650G>C(p.R217P)突變同樣具有上述特點。家系3先證者及同胞弟弟均有這兩種新突變，且他們都是OCA1A的患者，因而進一步支持兩種突變具有致病性。另外，對于上述新突變，本研究還在50名(100個等位基因)無白化病表型且無親緣關系的正常人中進行了篩查，結果均未見上述2種突變，因而我們認為c.1362+3A>T和c.650G>C(p.R217P)突變為致病性新突變。

本實驗結果證明從毛發提取DNA進行OCA分型診斷與研究的可行性，為今后推廣使用奠定了基礎；同時確定了2種致病性新突變，為我國OCA分型診斷、產前基因診斷以及分子發病機制研究積累了重要資料。

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AnewmethodforoculocutaneousalbinismtypingandanalysisoftwonovelmutationsinTYRgene

LIAO Pei-xi1, LI Zhuo2, PANG Ting3, JIANG Wei-ying3, LI Hong-yi3

(1GuanghuaSchoolofStomatology,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;2DivisionofLifeScience,SchoolofScience,HongKongUniversityofScienceandTechnology,Kowloon,HongKong,China;3DepartmentofMedicalGenetics,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:jweiying@mail.sysu.edu.cn;lihongyi@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To establish a new approach to oculocutaneous albinism(OCA) classification using the DNA extracted from hair bulb and identify two novel pathogenic mutations inTYRgene.METHODSThe morphological changes of hair bulb tissues were observed under optical microscope. The target DNA fragments of axons, promoter and exon-intron adjacent were amplified by PCR, followed by direct DNA sequencing. The novel mutations were further analyzed using mutant allele frequency method.RESULTSThe 3 probands were all tyrosinase-related OCA(OCA1). The proband in family 1 showed as a compound heterozygote with mutants of c.715C>T (p.R239W) and c.929insC (p.P310PfsX7). The proband in family 2 showed as a homozygote with c.896G>A (p.R299H). The proband in family 3 was a compound heterozygote with mutants of c.1362+3A>T and c.650G>C (p.R217P). The mutations of c.1362+3A>T and c.650G>C (p.R217P) were novel. The result of mutant allele frequency indicated that the novel mutations were most likely pathological mutations.CONCLUSIONWe successfully establish a feasible approach to OCA classification using the DNA extracted from hair bulb,and identify two novel mutations.

Oculocutaneous albinism; Hair; Gene mutation

R394.3

A

1000-4718(2011)03-0571-06

2010-11-16

2011-01-17

國家自然科學基金資助項目(No.30672003)；廣東省醫學科研基金資助項目(No.A2009351)；中山大學醫科學生科研項目(No.2009-11)

△通訊作者 Tel: 020-87330828;E-mail: jweiying@mail.sysu.edu.cn;lihongyi@mail.sysu.edu.cn

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.029