TLR活化參與環孢素A誘發的慢性腎小管間質損傷

洪英禮, 金英順, 崔鎮花, 陳 瑛, 李 燦

(延邊大學附屬醫院腎內科，吉林 延吉 133000)

TLR活化參與環孢素A誘發的慢性腎小管間質損傷

洪英禮, 金英順, 崔鎮花, 陳 瑛, 李 燦△

(延邊大學附屬醫院腎內科，吉林 延吉 133000)

目的探討慢性腎小管間質損傷的免疫發生機制。方法Sprague-Dawley大鼠皮下注射環孢素A(CsA,15 mg·kg-1·d-1) 4周建立慢性腎小管間質損傷模型，對照組給予皮下注射橄欖油 (1 mL·kg-1·d-1)。檢測兩組大鼠的腎功能；三色染色和免疫組織化學染色確定腎小管間質損傷程度(炎性細胞浸潤和帶狀纖維化)；熒光原位雜交技術和免疫組織化學染色分別觀察腎內Toll樣受體(TLR)、TLR配基-熱休克蛋白70 (HSP70)及補體系統成分(C3、C4d和C9)的表達。結果與對照組相比，腎毒性組表現為腎功能低下、腎間質大量ED-1陽性細胞浸潤、腎小管間質帶狀纖維化(P<0.01)。同時，腎毒性組TLR2和TLR4的mRNA 和蛋白水平明顯上調；TLR 配體 HSP70 免疫活性增加；補體C3、C4d和C9的免疫活性顯著增加。這些高表達的免疫成份主要位于腎小管間質受損部位。結論激活的腎內天然免疫與CsA引起的慢性腎小管間質損傷有關。

腎小管間質損傷； 天然免疫； 受體,Toll樣； 熱休克蛋白質70； 補體； 環孢菌素

天然免疫(innate immunity)應答是機體防御感染性疾病的第一防線，天然免疫是由Toll樣受體 (Toll-like receptor, TLR)及其配體所介導[1]。最近研究表明，TLR通過識別不同病原體的病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)在抗感染天然免疫中發揮作用。TLR可對PAMP 進行識別，引發的信號轉導途徑能導致炎癥介質的釋放，在天然免疫防御中起重要作用，并最終激活獲得性免疫系統。因此，TLR控制著由天然免疫向獲得性免疫的轉變。然而，有關天然免疫引起腎損傷的報道甚少。

環孢素A(cyclosporine A, CsA)是一種強有力的免疫抑制劑，但長期使用可引起慢性 CsA 腎毒性，導致移植腎功能延遲(delayed graft function)，限制了其在臨床的使用。研究表明，慢性 CsA 腎毒性以慢性腎小管間質損傷為特點，表現為腎小管間質炎癥和帶狀纖維化[2]，其分子機制尚不完全明確，目前認為與炎癥介質[3]、轉化生長因子β1[4]等有關。本實驗利用慢性 CsA 腎毒性動物模型旨在探討：1)是否慢性腎小管間質損傷與腎內激活的天然免疫系統有關；2)是否補體系統參與了慢性腎小管間質損傷。

材 料 和 方 法

1動物模型

雄性Sprague-Dawley大鼠, 體重220-240 g, 喂食低鹽飲食下(0.05 % sodium, Teklad Premier) 隨機分成2組：對照組 (n=6)：皮下注射橄欖油 (1 mL·kg-1·d-1, Sigma) 4周；CsA毒性組 (n=8) 皮下注射 CsA (15 mg·kg-1·d-1, Novartis Pharma) 4周。

2腎功能測定

監測2組大鼠的體重。處死大鼠前，將大鼠放入代謝籠中(Tecniplast Gazzada)，采血、收集24 h尿,測定血清和24 h尿肌酐, 用以下公式計算肌酐清除率: (24 h尿量×尿肌酐/血清肌酐)/100 g BW。

3腎臟病理

腎組織由過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液(periodate-lysine-paraformaldehyde) 固定, 石蠟包埋后切片(厚4 μm)。脫蠟后行三色(Masson trichrome) 染色,觀察腎小管間質纖維化。采用我們以往方法[5]評估腎小管間質纖維化程度，利用數字化顯微鏡分析儀(TDI Scope EyeTMVersion 3.0 for Windows, Olympus)，每張切片上至少觀察20個不同區域。在100倍顯微鏡下，獲取圖像，利用 Polygon Program定量地計算腎皮質受損部位的百分數。由2個觀察者對每個樣本隨機進行盲法評分。

4免疫組織化學染色

免疫組化步驟如下：石蠟包埋的切片置二甲苯脫蠟和梯度乙醇中脫水, 室溫下 (37 ℃) 0.3% H2O2/甲醛30 min處理后, PBS液洗3次。置微波爐中加熱 5 min行抗原修復 (98 ℃)，PBS 液洗3次。滴加非免疫性血清封閉液, 室溫下進行20 min。PBS液洗3次后，在4 ℃下滴加Ⅰ抗孵育12-16 h (ED-1, Serotec Inc.; C3, Santa Cruz Biotechnology; C4d, Quidel Corporation; C9,由Cardiff大學Dr.B.P.Morgan提供；TLR2, Im-genex; TLR4, Santa Cruz; HSP70, Stressengen)。PBS 液洗3次后滴加Ⅱ抗, 室溫孵育2 h。以DAB為底物顯色, 呈棕黃色為止(具體調節時間)。自來水流水洗滌,復染蘇木素，常規樹脂封片。數字化顯微鏡分析儀(Polygon Program)定量地計算抗體染色的百分數和ED-1陽性細胞計數。

5TLR2、TLR4的原位雜交(insituhybridization)

利用 DIG RNA 標記的試劑盒制備TLR2、TLR4 特異探針，在石蠟包埋的切片按照常規方法進行原位雜交。具體方法如下：二甲苯脫蠟和梯度乙醇中脫水, 室溫下 (37 ℃) 0.3% H2O2/甲醛30 min處理后, PBS液洗3次。置微波爐中加熱5 min行波爐抗原修復 (98 ℃)，PBS 液洗3次。分別置0.2 mol/L鹽酸和1%Triton X-100液中15 min，室溫下與10 mg/L蛋白酶K (Boehringer Mannheim) 浸漬20 min，2×SSC液沖洗后在含有50%除去離子的甲醛、4×SSC、2×Dehardt′s、1 g/L salmon-sperm DNA、1 g/L yeast transfer RNA液中與0.3 mg/L digoxigenin-labeled sense或antisense TLR2、TLR4特異探針過夜進行雜交。室溫下切片0.1×SSC沖洗后，雜交過的探針用羊抗-DIG抗體(Fab)結合堿性磷酸酶標記，以NBT/X-磷酸酶(Boehringer Mannheim)顯影。數字化顯微鏡分析儀(Polygon Program)定量地計算腎皮質顯影部位的百分數。

6統計學處理

結 果

1慢性腎小管間質損傷

與對照組相比，在毒性組腎組織中，可以觀察到大量ED-1陽性細胞浸潤(83±14vs11±2,P<0.01), 見圖1D、表1；還可見腎小管間質帶狀纖維化[(25±5)%vs(0±0)%,P<0.01], 見圖1B、表1。同時，腎功能低下，表現為血肌酐的上升[(109.7±12.5)μmoL/Lvs(58.1±2.0)μmoL/L,P<0.01]和肌酐清除率的下降[(0.16±0.03) mL·min-1·100 g-1vs(0.57±0.05) mL·min-1·100 g-1,P<0.01], 見表1。以上結果表明腎小管間質嚴重受損。

表12組大鼠腎功能及腎小管間質損傷程度

Table 1. Renal function and quantitative analysis of tubulointerstitial fibrosis and inflammatory cell infiltration

SCr(μmol/L)CCr(mL·min-1·100g-1)TIF(%)ED-1-positivecellControl(n=6)58．1±2．00．57±0．050±011±2CsA(n=8)109．7±12．5??0．16±0．03??25±5??83±14??

**P<0.01vscontrol group. SCr: serum creatinine; CCr: creatinine clearance rate; TIF: tubulointerstitial fibrosis.

Figure 1. The degree of tubulointerstitial injury detected by Masson trichrome staining (A,B) and immunohistochemistry for ED-1(C，D). A，C: control group; B，D: CsA group.

圖1腎小管間質損傷程度

2TLR2mRNA和蛋白的表達

如圖2所示，正常腎組織中可以觀察到TLR2 mRNA和蛋白的表達，主要位于腎小管上皮細胞，而腎間質沒有TLR2的表達。與對照組相比，毒性組大鼠腎TLR2 mRNA和蛋白的表達明顯增加，特別是在腎小管間質細胞或浸潤細胞中高表達[mRNA：(18±3)%vs(6±2)%；蛋白：(23±5)%vs(6±3)%,P<0.01]。

Figure 2.Insituhybridization (A,B) and immunohistochemistry (C,D) for TLR2 mRNA and protein expression. A,C: control group; B,D: CsA group.

圖2TLR2的RNA原位雜交

3TLR4mRNA和蛋白的表達

TLR4的表達情況與TLR2極為相似。與對照組相比，毒性組大鼠腎TLR4 mRNA和蛋白的表達明顯增加[mRNA：(27±8)%vs(5±2)%；蛋白：(25±9)%vs(4±2)%,P<0.01]，見圖3B、D。

Figure 3.Insituhybridization (A,B) and immunohistochemistry (C,D) for TLR4 mRNA and protein expression. A,C: control group; B,D: CsA group.

圖3TLR4的RNA原位雜交

4熱休克蛋白70蛋白的表達

熱休克蛋白70(heat-shock protein 70,HSP70)蛋白被認為是天然免疫的配體。免疫組化結果顯示對照組腎髓質正常表達HSP70，皮質可以觀察到少量HSP70蛋白。CsA 4周治療后，腎髓質HSP70的表達不增加，而皮質HSP70的免疫活性明顯增加[(75±10)%vs(10±6)%,P<0.01]，見圖4B。

5補體系統成分的表達

與對照組相比，毒性組補體C3、C4d和C9的免疫活性顯著增加，主要是腎小管上皮細胞、間質細胞、浸潤細胞，尤其是在腎小管間質受損部位[C3：(38±14)%vs(2±1)%；C4d：(30±3)%vs(5±3)%；C9：(35±11)%vs(9±6)%,P<0.01]，見圖5。

討 論

TLR 是數年前研究果蠅胚胎發育中發現的背腹側分化基因(dToll)編碼的一種跨膜受體蛋白。哺乳動物的天然免疫分子Toll樣受體是Toll樣蛋白的同源體，在識別和抵御各種病原微生物中發揮作用，參與免疫反應。目前已被確認的成員共有10個[1]。最近學者發現，激活的TLR參與了腎缺血再灌注損傷[6]、慢性腎衰竭[7]、急性腎移植排斥反應和移植腎功能延遲[8]，給予TLR抑制劑CpG-ODN明顯改善小鼠系統性紅斑狼瘡性腎炎[9]，確定TLR在腎損傷中的作用。本實驗利用RNA原位雜交和免疫組化技術探討天然免疫系統家族在腎小管間質的表達與分布。結果表明，對照組腎小管上皮細胞中僅有少量TLR2和TLR4 mRNA和蛋白的表達，而在毒性組其表達明顯上調，位于近曲、遠曲腎小管上皮細胞、間質細胞、浸潤細胞。有趣的是，這些高表達主要分布于腎小管間質損傷部位。由此，我們推測激活的TLR2和TLR4 參與了CsA所致慢性腎小管間質損傷的天然免疫。

Figure 4. Immunohistochemistry for heat-shock protein 70. A: control group; B: CsA group.

圖4熱休克蛋白70的免疫組織化學染色

Figure 5. Immunohistochemistry for C3 (B), C4d(C)and C9(D). A: control group; B-D: CsA group.

圖5補體系統成分的免疫組織化學染色

炎癥細胞浸潤、細胞外基質參與了慢性 CsA 腎小管間質損傷的過程。因此，受損的腎小管細胞和降解的細胞外基質可釋放、產生大量的內源性物質如TLR配體。基于HSP70來源于受損細胞并參與內源性天然免疫調節作用[10]，本研究檢測HSP70的表達。結果表明，對照組腎皮質僅觀察到少量HSP70蛋白，而在毒性組大鼠腎中，HSP70的表達顯著上調，主要位于皮質、外髓質的腎小管上皮細胞、間質細胞，該部位正是CsA的損傷靶區域。綜上所述， HSP70免疫活性增加可能協同TLR2和TLR4以自分泌或旁分泌方式參與了天然免疫反應，導致慢性腎小管間質損傷。

補體通過經典途徑、甘露糖結合凝集素途徑(mannan-binding lectin, MBL)或旁路替代途徑被激活，從而參與天然免疫系統。其中，C3參與各種腎臟疾病的發展。Tang等[11]和Welch等[12]報道C3在正常腎組織中沒有表達，僅在彌漫性炎癥狀態下或局灶節段硬化的腎組織中高表達。C4d被認為抗體介導的慢性移植腎病中排斥反應的一種標志物[13]，但在其它疾病中如缺血再灌注腎損傷中亦有表達。C9即膜攻擊復合物(membrane attack complex, MAC)是補體激活的終末產物，介導慢性腎小管間質損傷。本研究利用免疫組化檢測C3、C4d和MAC(C9)在腎內的表達。結果表明，C3、C4d和C9的免疫活性明顯增加，與TLR的表達相似，這些補體成分的高表達同樣位于腎小管間質受損區域。激活的補體系統參與天然免疫介導的慢性腎小管間質損傷。此外，激活的TLR間接地誘導補體產生，因為TLR4敲除小鼠比野生型小鼠表現為低的C3水平[14]。

綜上所述, 在CsA引起的慢性腎小管間質損傷中，CsA激活天然免疫系統導致免疫性腎損傷。本研究結果為各種非免疫性腎疾病中免疫性腎損傷的機制研究提供了分子理論基礎。

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ActivatedToll-likereceptorsparticipateinchronicrenaltubulointerstitialinjuryinducedbycyclosporineA

HONG Ying-li, JIN Ying-shun, CUI Zhen-hua, CHEN Ying, LI Can

(NephrologyandDialysisUnit,DepartmentofInternalMedicine,YanbianUniversityHospital,Yanji133000,China.E-mail:canlimd@yahoo.com)

AIM: To study the role of innate immunity in the pathogenesis of renal tubulointerstitial injury.METHODSThe model of nephrotoxic nephropathy was induced by chronic cyclosporine A (CsA) administration (15 mg·kg-1·d-1for 4 weeks) in Sprague-Dawley rats. The tubulointerstitial injury, characterized by inflammatory cell infiltration and striped fibrosis, was examined by the methods of immunohistochemistry and trichrome staining. The expression of Toll-like receptors (TLR), TLR ligand heat-shock protein 70 (HSP70)and intrarenal complement elements (C3, C4d and C9) was evaluated in rat kidneys by the methods ofinsituhybridization and immunohistochemistry.RESULTSCompared with the normal rats, the rats exposed to CsA showed impaired renal function, ED-1-positive cell infiltration and striped tubulointerstitial fibrosis (allP<0.01). Concomitantly, CsA treatment up-regulated the expression of TLR2 and TLR4 at mRNA and protein levels in renal tubular cells, accompanied by increased putative TLR ligand (HSP70) and the immunoreactivity of intrarenal complements. These up-regulated innate immunity components were located in the areas of severe tubulinterstitial injury.CONCLUSIONCsA-induced renal tubulointerstitial injury is closely associated with the activation of intrarenal innate immunity.

Tubulointestitial injury; Innate immunity; Receptors,Toll-like; Heat-shock proteins 70; Complement; Cyclosporine

R363

A

1000-4718(2011)03-0555-05

2010-03-15

2010-12-02

△通訊作者Tel：0433-2660799; E-mail: canlimd@yahoo.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.026