黃芩甙對牙周炎小鼠血清白細胞介素-6和白細胞介素-4水平的影響*

饒利佳, 盧嘉健, 呂芳麗, 李東健， 黃世光△

(1暨南大學醫學院口腔醫學系，廣東 廣州 510632；2中山大學醫學院寄生蟲教研室，廣東 廣州 510080；3廣州市荔灣區口腔醫院， 廣東 廣州 510170)

黃芩甙對牙周炎小鼠血清白細胞介素-6和白細胞介素-4水平的影響*

饒利佳1, 盧嘉健1, 呂芳麗2, 李東健3， 黃世光1△

(1暨南大學醫學院口腔醫學系，廣東 廣州 510632；2中山大學醫學院寄生蟲教研室，廣東 廣州 510080；3廣州市荔灣區口腔醫院， 廣東 廣州 510170)

目的觀察黃芩甙對小鼠實驗性牙周炎血清白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-4(IL-4)的影響，探討黃芩甙對牙周炎的免疫調節作用機制。方法建立小鼠實驗性牙周炎模型，并予以黃芩水提取物灌胃治療。 實驗采用SPF級12周齡雄性KM小鼠27只，隨機分為3組：正常對照組；實驗性牙周炎組：參照Kimura等的方法，復制小鼠實驗性牙周炎模型；黃芩甙治療組：復制小鼠實驗性牙周炎模型，并于建模后5 周開始用黃芩水提取物灌胃。各組小鼠分別在建模后第4、6、8 周分批處死，各時點每組處死動物數為3只。制作牙體牙周組織聯合切片，觀察牙周的組織學改變；采用ELISA法檢測實驗性牙周炎小鼠外周血IL-6和IL-4的水平。結果實驗性牙周炎組牙周組織表現為中等程度的炎癥破壞，而黃芩甙治療組牙周組織炎癥程度較牙周炎組明顯減輕，修復反應明顯；牙周炎組血清IL-6水平顯著高于正常對照組和黃芩甙治療組(P<0.01)；黃芩甙治療組血清IL-6的含量在6和8 周時顯著低于牙周炎組(P<0.01)；牙周炎組血清IL-4水平顯著低于正常對照組和黃芩甙治療組(P<0.01)，而黃芩甙治療組血清IL-4的含量在6和8周時顯著高于牙周炎組(P<0.01)。結論牙周炎的發病過程與Th1/Th2細胞因子的失調密切相關，表現為IL-6升高，IL-4降低；黃芩甙通過降低牙周炎IL-6的含量，增加IL-4的分泌量，糾正牙周炎Th1/Th2細胞因子的失調狀況，對小鼠實驗性牙周炎有明顯的治療效果。

牙周炎； 白細胞介素類； 黃芩甙

近年來研究表明牙周致病菌誘導以Th1為主的細胞免疫反應[1]，可不同程度地促進牙齦組織炎癥、加速牙周結締組織的破壞和牙槽骨的吸收。大鼠被動轉移實驗顯示Th1細胞因子可加重牙周疾病和牙槽骨吸收，而Th2細胞因子主要介導體液免疫反應，對牙周病具有防護作用[2]。體內外研究顯示黃芩甙(baicalin)在清除氧自由基、抗炎和免疫調節等多方面具有作用[3]。本實驗通過檢測牙周炎小鼠牙周的組織學改變，同時檢測血清中細胞因子白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和白細胞介素-4(interleukin-4,IL-4)的水平變化，分析黃芩甙對小鼠牙周炎的治療效果，從細胞免疫學的角度分析其免疫調節的作用機制。

材 料 和 方 法

1材料

清潔級昆明(KM)小鼠購自中山大學醫學院實驗動物中心；黃芩提取物(黃芩甙含量：≥90% HPLC)由香港大學陳劍萍助理教授惠贈；小鼠IL-4和IL-6 ELISA檢測試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。

2方法

2.1實驗動物分組及牙周炎動物模型的建立

① 動物分組 SPF級12周齡雄性KM小鼠27只，體重約32-36 g，于室內采光條件良好、清潔、安靜、通風良好、室溫約22 ℃左右、光照周期12 h∶12 h、無特殊致病菌的環境中適應性飼養1周后實驗。小鼠按隨機數字表法分成3組, 每組9只: (1) 正常對照組(control group)：動物正常喂養,牙周不做特殊處理； (2) 實驗性牙周炎組(experimental periodontitis group)：參照Kimura等[4]的方法，用5-0無菌醫用縫合絲線結扎雙側上頜第1磨牙牙頸部，管飼接種牙周致病菌，并輔以10%葡萄糖水喂養4周，建立小鼠實驗性牙周炎模型；于建模后5周開始蒸餾水灌胃，連續觀察至第8周；(3) 黃芩甙治療組(Baicalin treatment + periodontitis group)：同上法復制實驗性牙周炎模型，并于建模后5 周開始用黃芩水提取物混懸液(0.48 g·kg-1·d-1)灌胃，連續觀察至第8周。分別于術后第4、6和8周分批處死小鼠,各時點每組處死的動物數為3只。

② 牙周炎動物模型的建立 實驗開始前3 d，用氨芐青霉素溶液0.2 mL(含氨芐青霉素2 mg)灌胃，每天1次，連續3 d，抑制內源性雜菌生長，保證牙周致病菌的成功種植。建模時用0.7%戊巴比妥鈉溶液[0.1 mL/10 g BW(body weight)ip]麻醉,取仰臥位，固定四肢及頭部于手術臺上。1%碘酊消毒口腔及口周，并用75%乙醇脫碘，用尖探針分離雙側頜第1磨牙牙齦組織，用5-0絲線嵌入第1、2磨牙鄰間牙頸部，于第1磨牙近中牙齦乳頭處結扎固定，在前庭溝區打結，結扎線置于齦溝內。造模后喂10%葡萄糖注射液，連續觀察4周。

收集臨床確診為慢性牙周炎患者的病變區域齦緣下細菌，置于盛有1.0 mL硫乙醇酸鹽溶液的小瓶中，并充分混勻，以生理鹽水進行10倍系列稀釋，選擇稀釋度為10-3的濃度接種于CDC厭氧血瓊脂平板上，在厭養菌培養箱中37 ℃培養5 d，用PBS 溶液洗脫離心收集濕菌，用培養液制成細菌懸液以備接種用。實驗性牙周炎組、黃芩治療組小鼠經絲線結扎牙頸部后通過管飼方法，每只小鼠每次給予菌懸液0.2 mL，初次接種后每48 h追加1次，共管飼菌懸液3次。

黃芩提取物按小鼠體重折算的計量以蒸餾水配成混懸液(0.48 g·kg-1·d-1) 灌胃，從結扎的第5周起開始灌胃給藥，連續觀察4周；正常對照組、實驗性牙周炎組從第5 周起每天給予等量的蒸餾水灌胃。

2.2觀察指標及檢測方法

① 組織學觀察 采用頸椎脫臼法處死小鼠，取上頜骨標本于10%中性福爾馬林液中固定48 h以上，修整標本，僅保留磨牙區段牙齒及牙周組織。采用混合脫鈣液脫鈣，制成頰舌向5 μm厚度的牙體牙周組織聯合切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察結合上皮、上皮下炎癥細胞浸潤及牙槽骨的吸收情況。

② 血清標本的采集和IL-6、IL-4含量的測定 小鼠于剖殺時心臟取血，置于無菌不含抗凝劑的試管中, 室溫靜置2 h，放置4 ℃過夜, 3 000 r/min離心10 min,分離收集上層血清,于-20 ℃冰箱內冷凍保存。采用ELISA法檢測小鼠血清IL-6的含量：用抗小鼠IL-6單抗包被于酶標板上，復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素與生物素結合，加入酶底物四甲基聯苯胺，經酶作用后顯天藍色，加終止液硫酸反應后變黃色，在波長為450 nm處測吸光度(absorbance,A)值，通過繪制標準曲線求出標本中IL-6濃度。IL-4檢測方法同上。

3統計學處理

結 果

1組織學改變

正常對照組：牙齦上皮及結合上皮完整，牙周膜

膠原纖維排列整齊，牙槽骨完整無吸收，見圖1A。牙周炎組：4周時結合上皮及附近見慢性炎細胞浸潤，血管擴張充血，可見輕度牙槽骨吸收,見圖1 B；6周時結合上皮下見明顯炎細胞彌漫浸潤，膠原纖維排列紊亂，牙槽骨中度吸收,見圖1C；8周時，膠原纖維破壞、結構消解，可見大量炎癥細胞浸潤，牙槽嵴及牙槽骨明顯吸收,見圖1D。黃芩甙治療組， 4周時與牙周炎組的情況基本相似,見圖1E ；6周時結合上皮水腫、增生、上皮下方及結締組織均有輕度的炎細胞浸潤，牙周膜纖維排列不規則，牙槽骨輕度吸收，骨小梁稀疏,見圖1F；8周時淋巴細胞浸潤明顯減少，牙周膜纖維排列較整齊，膠原纖維粗大，骨吸收陷窩消失，可見牙槽骨新生跡象,見圖1G。

Figure 1. Histological changes in periodontal tissues(HE staining, ×10). A: normal control group; B:experimental periodontitis group (4 weeks), moderate inflammation was present; C: experimental periodontitis group (6 weeks), severe inflammation was present; D: experimental periodontitis group (8 weeks), severe periodontal destruction was present; E: baicalin treatment + periodontitis group (4 weeks), moderate inflammation was present; F: baicalin treatment + periodontitis at group ( 6 weeks), a small number of inflammatory cells were observed ; G: baicalin treatment + periodontitis group (8 weeks), only mild inflammation was found.

圖1各組牙周組織HE染色光鏡下觀察結果

2白細胞介素水平

小鼠血清IL-6水平見表1，實驗性牙周炎組IL-6水平明顯高于正常對照組和黃芩甙治療組(P<0.01)；黃芩甙治療組血清IL-6的含量在6和8周時顯著低于牙周炎組(P<0.01)；黃芩治療組血清IL-6的含量在6和8周時與正常對照組相比較無顯著差異(P>0.05)。

小鼠血清IL-4的水平見表2，實驗性牙周炎組IL-4水平明顯低于正常對照組和黃芩治療組(P<0.01)；黃芩甙治療組血清IL-4的含量在6和8 周時顯著高于實驗性牙周炎組(P<0.01)；黃芩甙治療組血清IL-4的含量在6和8 周時與正常對照組相比較無顯著差異(P>0.05)。

表1各實驗組及對照組小鼠血清IL-6濃度的變化

Group4weeks6weeks8weeksControl28．42±4．1529．30±3．5728．01±4．06Periodontitis49．21±3．62??48．53±5．29?? 50．00±4．31??Baicalintreatment+periodontitis48．53±3．58??30．47±4．61▲▲ 29．57±5．35▲▲

**P<0.01vscontrol group；▲▲P<0.01vsperiodontitis group.

表2各實驗組及對照組小鼠血清IL-4濃度的變化

Group4weeks6weeks8weeksControl22．64±3．0621．30±3．1021．01±2．81Periodontitis11．78±1．41??12．93±1．39?? 12．00±1．56??Baicalintreatment+periodontitis12．16±1．65??19．98±1．21▲▲ 19．70±1．46▲▲

**P<0.01vscontrol group；▲▲P<0.01vsperiodontitis group.

討 論

目前研究顯示牙周炎的發病過程與細胞因子的分泌異常導致促炎/抑炎平衡失調有密切關系，即Th1細胞功能相對亢進，Th2細胞功能不足。IL-6能刺激破骨細胞分化和骨吸收，抑制牙槽骨形成；抑制牙周膜細胞的生長和牙周膜的修復；促進血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的生成，加重牙周組織的病變[5]。我們在本實驗中觀察到小鼠牙周炎時結合上皮及附近結締組織見炎細胞浸潤，膠原纖維排列紊亂，牙槽嵴及牙槽骨明顯吸收；血清IL-6含量顯著升高，IL-4含量明顯下降，結果顯示牙周炎時Th1/Th2應答平衡的失調導致牙周炎加重，糾正這種Th1/Th2應答失衡有利于改善牙周炎的病變進程。近年來一些學者采用介導Th2反應的病原體(如腸道蠕蟲等)和介導Th1反應的病原體(如細胞內原蟲、細菌和病毒等)共感染，研究體內Th1/Th2細胞因子平衡的相互調節對疾病病程的影響，取得了有重要價值的實驗治療效果[6-8]。我們近期的研究工作顯示，與對照組相比，牙周炎造模小鼠接種低劑量旋毛蟲(Trichinellaspiralis) 誘導Th2細胞反應使牙周病指征明顯減輕[9,10]。已知IL-6、TNF-α和IL-1β等是造成牙周炎的細胞因子網絡中的關鍵成員，如果我們能夠對這些因子的產生及其生物學效應進行有效的調控就可以減輕其對牙周組織的損害，對牙周炎的治療有著積極的意義，有望成為牙周炎免疫治療的有效手段。

黃芩提取物為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根提取而得，其有效成分為黃芩甙。 黃芩甙對多種細菌包括厭氧菌、皮膚真菌、鉤端螺旋體等都有抑制作用；黃芩水浸膏對牙齦卟啉單胞菌及牙周可疑致病菌的生長及內毒素有抑制作用，但不對牙周有益菌如血鏈球菌等產生抑制作用[11]。黃芩黃素能抑制金黃色葡萄球菌外毒素誘發的T淋巴細胞的增殖，降低炎癥介質IL-1β、IL-6、TNF-α和巨噬細胞炎癥蛋白的水平，降低由內毒素刺激的一氧化氮(nitric oxide，NO)合成，起到抗炎作用。黃芩甙能抑制牙周膜細胞合成分泌前列腺素 (prostaglandins, PGs)，并使PGs如PGE1和PGE2在5-羥前列腺素脫氫酶催化下失活；抑制細胞內炎癥介質白三烯B4和白三烯C4的生物合成；黃芩黃素還能顯著促進牙齦成纖維細胞增殖及膠原蛋白的合成[12]。黃芩甙通過抑制誘導性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)，減少毛細血管內皮細胞釋放NO，調節花生四烯酸的代謝，抑制PGE2和白三烯C4的合成[13]；通過選擇性抑制MMP-9等的表達而有效抑制TNF-α的功能[14]。本實驗的數據與其它一些研究結果相一致[15,16]，本研究的結果表明黃芩甙可抑制Thl細胞反應，降低IL-6的水平；我們的實驗結果還表明黃芩甙同時具有促進Th2細胞反應，升高IL-4的水平，對牙周炎具有顯著的治療效果，研究結果將為藥物治療牙周炎開辟一條新途徑。

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EffectsofbaicalinonserumlevelsofIL-6andIL-4inmouseperiodontitis

RAO Li-jia1, LU Jia-jian1, Lü Fang-li2, LI Dong-jian3, HUANG Shi-guang1

(1FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofParasitology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;3StomatologicalHospitalofLiwanDistrict,Guangzhou510170,China.E-mail:thshg@126.com)

AIM: To investigate the effect of baicalin on experimental periodontitis in mouse model by comparing the histological changes in periodontal tissues and serum levels of inter leukin(IL)-6/IL-4 in mice, and to analyze the role of baicalin in immune regulation and anti-inflammatory mechanisms.METHODSTwenty-seven male Kunming mice (SPF grade, 12-week-old) were randomly divided into 3 groups. The naive mice were used in normal control group. In experimental periodontitis group, the periodontitis model was produced by ligature of braided silk around the first maxillary molar and inoculation with putative periodontopathic bacteria. Five weeks after the ligature, the mice were fed with 10% glucose, and gavaged with distilled water. In baicalin treatment+periodontitis group, the periodontitis model was induced as above, then gavaged with baicalin at the beginning of the fifth week after the ligature. The mice were sacrificed at week 4, 6 and 8. The histological changes of the periodontal tissues were observed under microscope with hematoxylin and eosin (HE) staining. The serum level of IL-6 and IL-4 in the mice were determined by ELISA.RESULTSThe periodontal tissues showed moderate inflammatory damages in experimental periodontitis group. The periodontal destruction was significantly reduced in baicalin treatment+periodontitis group. The serum level of IL-6 in experimental periodontitis group was significantly higher than that in control group and baicalin treatment+periodontitis group (P<0.01), and the serum level of IL-6 in baicalin treatment+periodontitis group was significantly lower than that in periodontitis group at week 6 and 8 (P<0.01). The serum level of IL-4 in periodontitis group was significantly lower than that in control and baicalin treatment+periodontitis group (P<0.01). The serum level of IL-4 in baicalin treatment+periodontitis group was significantly higher than that in periodontitis group at weeks 6 and 8 (P<0.01).CONCLUSIONThe pathogenesis of periodontitis is closely related to the imbalance of Th1/Th2 cytokines, characterized by increased serum level of IL-6 and the decreased serum level of IL-4. Baicalin plays a significant role in treating mouse periodontitis by decreasing the serum level of IL-6 and increasing the serum level of IL-4.

Periodontitis; Interleukins; Baicalin

R78

A

1000-4718(2011)03-0550-05

2010-10-21

2011-01-04

暨南大學本科生創新工程項目(No.cx10127)

△通訊作者 Tel: 020-85221165; E-mail: thshg@126.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.025