新型大麻制劑O-1602和CBD減輕小鼠實驗性急性胰腺炎的機制研究*

馮佳燕, 李 琨, 林旭紅， 余良英， 李永渝

(同濟大學醫學院病理生理教研室，同濟大學消化系疾病研究所，上海 200092)

新型大麻制劑O-1602和CBD減輕小鼠實驗性急性胰腺炎的機制研究*

馮佳燕, 李 琨, 林旭紅， 余良英， 李永渝△

(同濟大學醫學院病理生理教研室，同濟大學消化系疾病研究所，上海 200092)

目的觀察2種新型大麻類制劑O-1602和大麻二酚(CBD)對雨蛙肽(CAE)誘導的小鼠急性胰腺炎(AP)的抗炎作用，并通過其對熱休克蛋白60(HSP60)表達的影響，探討其可能的機制。方法以CAE腹腔注射(50 μg·kg-1·h-1，共6次)復制小鼠AP模型，對照組用生理鹽水(NS)替代CAE；給AP小鼠腹腔注射O-1602或CBD作為治療組。組織學檢查評估不同處理組胰腺組織形態學改變；測定血漿淀粉酶及脂肪酶活性(生化法)、血漿細胞因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)及白細胞介素6(IL-6)的水平(ELISA法)，以及肺臟中髓過氧化物酶(MPO)活性的變化(生化法)；同時，用 real-time PCR和Western blotting測定胰腺組織熱休克蛋白(HSP60) mRNA和蛋白的表達特點。結果AP組小鼠胰腺組織出現明顯損傷及炎癥表現；此類表現在AP+O-1602及AP+CBD治療組得到明顯改善。AP組血漿淀粉酶及脂肪酶活性、TNF-α及IL-6水平、肺臟MPO水平較NS組均有顯著升高(P<0.05)；而在AP+O-1602及AP+CBD組，這些指標均較AP組明顯降低(P<0.05)。同時，胰腺組織HSP60 mRNA和蛋白的表達量在AP組均降低(P<0.05)， O-1602或CBD處理可一定程度提高HSP60的表達(P<0.05)。結論CAE可成功誘導小鼠AP的發生，并伴有一定程度的全身炎癥反應，O-1602和CBD可改善胰腺局部損傷程度及全身炎癥程度，其機制可能與大麻類物質對炎癥介質、細胞因子的抑制以及提高細胞保護因子HSP60的表達有關。

急性胰腺炎； 大麻素類； 熱休克蛋白質60

大麻類物質包括從大麻植物提取的生物活性成分-大麻(cannabinoid，CB)、人工合成的大麻素類制劑以及機體代謝產生的內源性脂質(內源性大麻類物質)，它們能作用于靶組織中的特定受體發揮效應[1]。大麻素受體(cannabinoid receptors)主要是一組屬于G蛋白偶聯受體超家族的細胞膜受體。在哺乳動物體內，已發現存在2種經典的大麻素受體，即CB1受體和CB2受體[2]。目前已知這2種受體參與機體多種功能活動的調節，在病理情況下與疼痛、炎癥等的發生發展關系密切。Smith等[3]證實CB1、CB2受體激動劑(WIN 55212-2、HU210)在抑制細胞因子及抗炎方面有明顯的作用。Michalski等[4]及Matsuda等[5]看到CB1、CB2受體激動劑可減輕AP所致的疼痛、炎癥程度并延長生存時間[4,5]。

隨著對大麻素系統的深入研究，最近一種也屬G蛋白偶聯受體，但非CB1受體、非CB2受體的大麻受體GPR55(G protein-coupled receptor 55)在哺乳類被發現，并受到了廣泛的關注[6]。目前對GPR55相關的大麻類制劑相繼被研發，大麻二酚(cannabidiol, CBD) 及O-1602是2種新型的大麻類制劑。前者首先發現于印度大麻中，是一種非精神作用的大麻類物質，其作用途徑較復雜，但已被很多研究證實在控制炎癥方面作用顯著[7,8]；后者為一種人工合成的大麻二酚類似物，能特異激活GPR55，對CB1、CB2受體無作用[9]。二者結構相似，見圖1，對其作用的相關研究報道較少，對AP的作用尚未見報道。

Figure 1. The structural fomulas of cannabidiol(CBD) and O-1602.

圖1CBD及O-1602的結構式

為了探討大麻素系統在AP發病過程中的可能作用，本實驗用經典方法即膽囊收縮素類似物雨蛙肽(caerulein,CAE)腹腔注射誘導小鼠急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)模型，以2種GPR55相關的新型大麻類制劑O-1602和CBD對AP動物進行處理，研究這2種新型大麻類制劑可能的抗炎作用及其作用機制。

材 料 和 方 法

1動物及分組

體重18-22 g 的C57BL小鼠 35只，雌雄各半，購自第二軍醫大學實驗動物中心。實驗前小鼠禁食不禁水16 h，隨機將小鼠分為5組(每組小鼠7只)：未處理組(正常組)、生理鹽水對照組(NS組)、急性胰腺炎組(AP組)、AP+O-1602組以及AP+CBD組。參照Ding等[10]的方法制備AP模型，即小鼠腹腔注射(ip)50μg/kg CAE(Sigma)，每小時1次，共6次(AP組)。NS組用生理鹽水替代雨蛙肽ip;AP+O-1602組及AP+CBD組在AP造模前0.5 h及造模過程5 h時點給O-1602(10 mg/kg，ip) 或CBD(1 mg/kg，ip)(Biotrend AG)。藥物劑量的確定通過預實驗及參考文獻[4]的方法。

2取材及各項指標的檢測

第6次注射CAE或NS后3 h，七氟醚(丸石制藥株式會社)吸入麻醉小鼠，斷頭取血，1%肝素抗凝處理，收集血漿標本，-80 ℃保存。仔細分離并取出胰腺、肺臟。胰腺組織分成若干份，1份迅速置于4%多聚甲醛，其余組織生理鹽水沖洗、濾紙吸干、稱重，-80 ℃保存，用于以下相關指標檢測。

2.1胰腺組織形態學檢測 將置于4%多聚甲醛中的胰腺組織進行石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色。光學顯微鏡下觀察胰腺組織病理改變。

2.2血漿淀粉酶及脂肪酶活性檢測，肺組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性檢測,以及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)及白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)水平檢測 血漿淀粉酶、脂肪酶活性以及肺組織MPO活性按相關生化試劑盒(南京建成生物科技有限公司)說明書介紹的步驟檢測。MPO活性測定同時，使用蛋白定量試劑盒(BCA，Thermo)測定各檢測標本組織的蛋白量，從而換算得出每毫克組織蛋白的MPO活性水平。血漿TNF-α以及IL-6水平按相關ELISA試劑盒(R&D)說明書介紹的步驟檢測。

2.3Real-time PCR檢測胰腺組織中HSP60 mRNA的表達 參照Li等[11]的方法，即采用Trizol(Invitrogen)提取胰腺組織總RNA，將其逆轉錄成cDNA(TaKaRa逆轉錄試劑盒)后,以熒光定量PCR儀(上海楓嶺生物技術有限公司)進行基因擴增。PCR反應條件為：95 ℃預變性10 s,95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，45個循環擴增。以HSP60的copy數與內參照3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)的copy數的比值計算HSP60 mRNA相對表達量。HSP60正義鏈5’- GGCTATCGCTACTGGT -3’，反義鏈5’-GCAAGTCGCTCGTTCA-3’,產物長292 bp；GAPDH正義鏈5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ’，反義鏈5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，產物長490 bp(Primer 5.10 軟件設計，Invitrogen公司合成)。

2.4Western blotting檢測胰腺組織中HSP60蛋白的表達 取胰腺組織加入蛋白裂解液[組成：25 mmol/L HEPES(pH 7.5),1mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L MgCl2,1% NP40, 2% glycerol,1mmol/L PMSF, 10 mg/L aprotinin]，均漿、充分裂解后，離心取上清液，檢測樣品蛋白濃度(BCA，Thermo)。等濃度樣品加入5×上樣緩沖液(碧云天生物技術研究所)，95 ℃煮沸10 min使蛋白變性。將樣品(40 μg蛋白)在4%-10%Tris-SDS-Page膠中電泳1.5 h，轉移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h;滴加HSP60單克隆抗體(1∶1 000稀釋, Strssgen)，4 ℃孵育過夜；滴加IR Dye800 共軛親和純化抗體(1∶5 000稀釋，Rockland)，室溫下孵育1 h；內參照用單克隆抗體β-actin(1∶1 000稀釋,

Sigma)。用Odyssey紅外雙色激光成像系統(LI-COR)檢測蛋白條帶；采用Image J分析蛋白條帶的光強度。HSP60蛋白的相對表達量用HSP60條帶的光強度與β-actin條帶光強度的比值表示。

3統計學處理

結 果

1胰腺組織病理改變

光鏡下觀察發現，與對照組比較，AP組胰腺組織呈現重度水腫及炎癥表現，大片胰腺腺泡腫脹，有空泡形成，間隙明顯增寬，中性粒細胞浸潤，血管擴張、充血明顯。在AP+O-1602及AP+CBD組，組織水腫及炎癥程度減輕，間質輕度增寬，組織仍可見充血及中性粒細胞浸潤，但程度減輕。2種藥物處理組相比，AP+O-1602組胰腺組織水腫程度更輕，見圖2。

Figure 2. Effect of O-1602 or CBD on the morphology of pancreatic tissues in mice with acute pancreatitis(AP)(HE staining,×400).A:normal:B:AP;C:AP+O-1602;D:AP+CBD.

圖2O-1602或CBD對急性胰腺炎小鼠胰腺組織形態學的影響

2血漿中淀粉酶和脂肪酶活性的改變

與正常組比較，NS組血漿淀粉酶、脂肪酶活性沒有明顯改變(P>0.05)；AP組血漿淀粉酶、脂肪酶活性與NS組比較顯著升高(P<0.05)；而AP+O-1602及AP+CBD組中，血漿淀粉酶、脂肪酶活性與AP組比較顯著降低(P<0.05)，與NS組比較仍維持在較高水平(P<0.05)；2種藥物處理組之間無顯著差異(P>0.05)，AP+CBD組的下降幅度較大,見圖3。

3血漿中TNF-α和IL-6水平的改變

如圖4所示， AP組TNF-α和IL-6水平均比NS組顯著升高(P<0.05)。與AP組比較，O-1602或CBD均可明顯降低AP小鼠血漿中的促炎細胞因子IL-6和TNF-α的水平(P<0.05)，其水平基本與NS組的相當(P>0.05)。

4肺臟組織中髓過氧化物酶活性變化

結果顯示于圖5，NS組肺組織MPO活性與正常組比較無明顯差異(P>0.05)；AP組肺組織MPO活性與NS組比較顯著升高(P<0.05)；O-1602或CBD均可明顯降低AP小鼠肺組織MPO活性(P<0.05)，與NS組的比較無顯著差異(P>0.05)。

5胰腺組織中HSP60mRNA的表達

如圖6所示，NS注射引起胰腺組織HSP60 mRNA表達水平顯著升高，與正常組比較差異顯著(P<0.05)，而CAE注射復制AP，胰腺組織HSP60 mRNA表達顯著降低，與NS組比較P<0.05。在AP+O-1602及AP+CBD組，胰腺HSP60 mRNA表達水平較AP組有明顯升高(P<0.05)，但與NS組比較仍處于低水平(P<0.05)。

圖3O-1602或CBD對急性胰腺炎小鼠血漿淀粉酶及脂肪酶活性的影響

圖4O-1602或CBD對急性胰腺炎小鼠血漿IL-6及TNF-α水平的影響

圖5O-1602或CBD對急性胰腺炎小鼠肺髓過氧化物酶(MPO)活性的影響

圖6O-1602或CBD對急性胰腺炎小鼠胰腺組織HSP60mRNA表達的影響

6胰腺組織中HSP60蛋白的表達

與正常組和NS組比較，AP時胰腺組織HSP60蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。如同其mRNA的表達一樣，在AP+O-1602及AP+CBD組HSP60蛋白的表達較AP組有所升高(P<0.05)，且較NS組無明顯變化(P>0.05), 見圖7。

圖7O-1602或CBD對急性胰腺炎小鼠胰腺組織HSP60蛋白表達的影響

討 論

AP是發生在胰腺組織的急性炎癥性疾病，有時亦累及胰腺臨近臟器和遠隔器官，其病理生理過程與許多因素有關，包括胰腺消化酶的激活、炎癥介質、細胞因子的大量產生等[12]。CAE是膽囊收縮素(cholecystokinin, CCK)的類似物，有研究揭示它可與胰腺細胞的CCK-A低親和受體結合，引起胰酶分泌，大劑量時可誘導AP發生[13]。因此，目前已被廣泛應用于AP實驗研究[4,9,14]。本實驗結果證實，經CAE誘發AP，胰腺局部出現明顯炎癥及損傷，大量胰酶釋放入血，同時有血漿促炎細胞因子水平增高，肺部組織也受累，MPO活性增高，提示有明顯的炎細胞浸潤。

大麻素系統主要包括機體內源性大麻素系統(endo-cannabinoid system，ECS)和外源性大麻類物質。ECS包括大麻素受體、大麻素受體的內源性配體以及相關合成和降解的酶類，在疼痛、炎癥、細胞生長死亡以及各種胃腸功能的生理和病理生理過程中起有重要的調節作用[15-20]。大量研究表明，大麻類物質具有抗炎鎮痛的作用，其機制與抑制炎癥介質、細胞因子的產生密切相關[18-20]。Michalski等[4]用大麻類制劑HU210(CB1和CB2受體激動劑)治療CAE誘導的急性胰腺炎，發現其不但能減輕胰腺炎引起的腹部疼痛，而且能控制炎癥反應，減輕胰腺組織的損傷。Matsuda等[5]研究發現，CB1受體特異性拮抗劑AM251可使牛磺膽酸鈉誘導的壞死性胰腺炎大鼠生存時間延長，但其對AP的血清指標(淀粉酶、IL-6等)以及組織局部損傷程度無影響。已有研究發現，CB的另一種受體(非CB1、CB2受體)GPR55存在于人腦與控制記憶、學習和運動功能相關的區域(背側紋狀體，尾狀核和殼)，也存在于人類回腸、脾、扁桃體、乳房等周圍組織[21]；我們課題組最近研究發現，胰腺中存在GPR55基因和蛋白的表達，主要在胰腺的腺泡細胞(結果待發表)。本實驗應用的新型大麻制劑O-1602認為是GPR55的特異激動劑，它的結構與CBD相似，是否也有CBD一樣的控制炎癥的作用尚不得知。

本實驗看到，給予O-1602及CBD的AP實驗組，胰腺局部炎癥及損傷均有所改善，血漿淀粉酶、脂肪酶以及細胞因子TNF-α、IL-6水平明顯下降，肺組織MPO活性明顯降低，全身炎癥反應得到緩解，揭示O-1602及CBD均有抗炎作用，其作用相當；同時證實GPR55涉及到炎癥的過程，其活性上調具有抑制炎癥的作用。目前，已有許多研究證實，大麻類制劑的抗炎作用與其對細胞因子的調節密切相關。Berdyshev等[22]研究顯示CB1、CB2受體激動劑Δ9-四氫大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol,Δ9-THC)及WIN 55212-2均在脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)誘導的小鼠支氣管炎模型中起作用，包括劑量依賴性地降低肺泡灌洗液中TNF-α的水平，并伴有中性粒細胞募集作用的減低。由本實驗結果也可推測，O-1602及CBD這2種新型大麻制劑可能通過調節促炎細胞因子的產生，控制AP的發生發展。

具有細胞保護效應的熱休克蛋白家族(heat shock proteins,HSPs)在AP中的作用目前已有一定的報道。HSP60是熱休克蛋白家族中的一員，在胰腺腺泡細胞中，有較多量的HSP60表達[23]，且在胰酶分泌通路中HSP60與胰酶關系密切[24,25]。我們近期的研究發現，實驗性AP其胰腺組織HSP60表達降低[11]，干擾HSP60的表達胰腺組織更易受到CAE、LPS引起的損傷[26]。Lee等[27]預先冷水浸漬誘導大鼠HSP60的高表達可以減輕CAE引起的AP大鼠胰腺的損害，且其機制為HSP60表達增高可使腺泡細胞內組織蛋白酶B移行受阻，從而抑制胰蛋白酶原的胞內激活。有趣的是，大麻素與HSPs之間也有著十分密切的關系。Chen等[28]通過微陣列分析發現，Δ9-THC的神經保護作用與其對HSP60的調節有關。我們的實驗揭示，AP時胰腺組織HSP60的基因或蛋白水平表達降低，這與我們以前的實驗結果相似；而經O-1602或CBD大麻類制劑處理的AP小鼠，胰腺組織中HSP60的基因和蛋白表達都有明顯升高。由此我們推測，這2種大麻類制劑不僅通過已知的大麻素抗炎機制減輕AP的病變程度，也通過促進HSP60的表達以拮抗損傷因子的作用，增加對胰腺的保護效應。

綜上所述，2種針對GPR55的大麻類新型制劑O-1602及CBD都能夠拮抗CAE誘導的AP及其引發的全身性炎癥反應，該作用機制可能與其抑制炎癥介質和促炎細胞因子的產生，增強HSP60的表達及其對的細胞保護作用有關。

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EffectsofnewkindsofcannabispreparationsO-1602andcannabidiolonexperimentalacutepancreatitis

FENG Jia-yan, LI Kun, LIN Xu-hong, YU Liang-ying, LI Yong-yu

(DepartmentofPathophysiology,InstituteofDigestiveDisease,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China.E-mail:liyongyu@tongji.edu.cn)

AIM: To investigate the therapeutic effects of O-1602 and cannabidiol (CBD), the new kinds of cannabis preparations, on caerulein (CAE)-induced acute pancreatitis (AP) in mice.METHODSAP was induced by intraperitoneal injection (ip) of CAE in mice (50 μg/kg hourly with a total of 6 times), and the mice in control group were given normal saline (NS) ip in stead of CAE in the same way. The AP mice were administrated O-1602 or CBD for the therapeutic evaluation by observing the following parameters: pathological changes of pancreatic tissue, plasma activity of amylase and lipase (biochemical methods), the levels of TNF-α and IL-6 in the plasma (ELISA), and the activity of myeloperoxidase (MPO) in the lung (biochemical methods). Meanwhile, real-time PCR and Western blotting were used to evaluate the expression of heat shock protein 60 (HSP60) at mRNA and protein levels, respectively.RESULTSThe pancreatic tissues in AP group appeared obvious edema and neutrophil infiltration, which were significantly improved by treating with AP+O-1602 or AP+CBD. The activity of amylase, lipase and MPO, as well as the levels of TNF-α and IL-6 in AP group significantly increased compared with NS group (P<0.05), while these parameters were significantly lower in AP+O-1602 group and AP+CBD group than those in AP group. Meanwhile, the expression of HSP60 at mRNA and protein levels in pancreas tissues was reduced in AP group (P<0.05), and was improved to some extent after treating with O-1602 or CBD (P<0.05).CONCLUSIONThe O-1602 and CBD show anti-inflammatory effects on CAE-induced AP in mice and the mechanisms might be related to the effects of cannabinoids on inhibiting inflammatory mediators and cytokines, and increasing the expression of cytoprotective factor HSP60.

Acute pancreatitis; Cannabinoids; Heat-shock protein 60

R363.2

A

1000-4718(2011)03-0539-06

2010-10-27

2011-01-11

國家自然科學基金資助項目(No．30971168)

△通訊作者Tel：021-65981021；E-mail:liyongyu@tongji.edu.cn

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.023