缺血預處理對失血性休克大鼠血管反應性及鈣敏感性的影響*

胡 弋, 李 濤, 徐 競, 唐小唪, 劉良明△

(第三軍醫大學大坪醫院1麻醉科，2野戰外科研究所二室，創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶 400042)

缺血預處理對失血性休克大鼠血管反應性及鈣敏感性的影響*

胡 弋1,2, 李 濤2, 徐 競2, 唐小唪1, 劉良明2△

(第三軍醫大學大坪醫院1麻醉科，2野戰外科研究所二室，創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶 400042)

目的觀察缺血預處理對失血性休克血管反應性和鈣敏感性的影響。方法通過觀察不同缺血預處理方法對失血性休克大鼠存活時間和24 h存活率的影響，選擇最適缺血預處理方法。在體實驗，觀察缺血預處理對失血性休克大鼠腸系膜上動脈(SMA)血管管徑對去甲腎上腺素 (NE)收縮反應性和NE升壓反應的影響；離體實驗，應用離體血管環張力測定技術，觀察缺血預處理對失血性休克后大鼠SMA環血管反應性和鈣敏感性的影響。結果確定最適缺血預處理方法為：夾閉腹主動脈1 min，開放5 min，重復3次，2 h后復制失血性休克模型，這種方法可顯著增加失血性休克大鼠的存活時間和24 h存活率。在體實驗，缺血預處理可顯著增加休克晚期NE的升壓效應和在體SMA對NE的收縮反應(P<0.01)。離體實驗，與失血性休克對照組比較，缺血預處理組SMA在休克早期(休克即刻)對NE的收縮反應性和鈣敏感性明顯下降(P<0.05)，但與正常對照組比較無顯著差異(P>0.05)；在休克后期(休克2 h、3 h、4 h)，缺血預處理組SMA對NE的收縮反應性和鈣敏感性顯著增加(P<0.05)，且與正常對照組比較無顯著差異(P>0.05)。結論缺血預處理可能通過改善血管鈣敏感性發揮對休克后期血管反應性的保護效應。

缺血預處理； 休克，出血性； 血管反應性； 鈣敏感性

材 料 和 方 法

1動物

清潔級SD大鼠112只，雌雄不拘，體重(218.0±25.6) g，由第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所實驗動物中心提供。

2不同IPC方法對失血性休克大鼠存活率和24h存活時間的影響

40只大鼠隨機分為失血性休克對照組、IPCⅠ、Ⅱ、Ⅲ組，每組大鼠均為10只。實驗前12 h大鼠禁食、自由飲水，實驗當天戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后, 經右側股動、靜脈插管,股動脈接水銀血壓計供放血和監測平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)，股靜脈供復蘇。IPCⅠ、Ⅱ、Ⅲ組打開腹腔，分離腸系膜上動脈(superior mesenteric artery,SMA)分支處的腹主動脈，分別夾閉腹主動脈1 min，開放5 min；夾閉3 min，開放3 min；夾閉3 min，開放5 min，均重復3次；失血性休克對照組則僅分離SMA分支處的腹主動脈。4組大鼠均在上述處理2 h后經右側股動脈導管放血，在10 min內將MAP降至40 mmHg，在此水平維持4 h后，將抽取的全血及等量乳酸林格氏液在30 min內回輸入大鼠體內，記錄大鼠24 h存活時間及存活率。

3IPC對失血性休克大鼠去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)升壓效應及在體SMA對NE收縮反應性的影響

24只大鼠隨機分為假手術組、失血性休克對照組和IPC組(根據上述實驗選擇最適IPC方法)，每組大鼠均為8只。其中失血性休克對照組和IPC組于復制失血性休克模型前、剝離大鼠SMA主干，分別在休克前，休克后10 min、30 min、1 h、2 h、3 h和4 h經股靜脈給予NE(3 μg/kg),記錄大鼠使用NE前后股動脈壓值，其差值即為NE作用后MAP變化，反映整體血管反應性；同時采用倒置顯微鏡(CK40，Olympus)觀察并記錄使用NE 前后大鼠SMA主干管徑的變化,以使用NE前后大鼠SMA管徑差值占使用NE前大鼠SMA管徑的百分率(%)來評價大鼠SMA對NE的收縮反應性。假手術組除不放血外，其它處理同失血性休克對照組。

4IPC對失血性休克大鼠離體SMA血管反應性和鈣敏感性的影響

完善科研項目經費預算管理，首先要提高項目負責人和財務部門對項目預算的認識，再依據實際情況編制更加科學合理的科研項目經費預算和按照規定流程調整預算。

104只大鼠隨機分為假手術組、失血性休克對照組和IPC組，其中失血性休克對照組和IPC組又根據休克時相點分為休克10 min、30 min、1 h、2 h、3 h和4 h 6個亞組，每組大鼠均為8只。處死大鼠取SMA，清除周圍結締組織，制作成2-3 mm長的血管環2根,其中1根用于血管反應性測定,另1根用于鈣敏感性測定。

將所取SMA血管環掛于注有Krebs-Henseleit液[K-H液(mmol/L)：NaCl 118， KCl 4.7，NaHCO325，KH2PO41.03 ，MgSO4·7H2O 0.45，CaCl22.5，葡萄糖11.1，pH 7.4]離體器官灌流槽的浴槽中，持續充入95%O2和5%CO2混合氣體，給預初張力0.5 g，37 ℃恒溫孵育2 h，每20 min換液1次,待張力曲線平穩后,測定血管環對NE的反應性。血管環張力通過張力傳感器連接至八道生理記錄儀(Power Lab，AD Instrument)記錄。按累積濃度法向浴槽K-H液中依次加入NE，使其終濃度分別為0.001、0.01、0.1、1.0和10 μmol/L。記錄不同NE濃度下 SMA環產生的最大收縮力。以NE濃度和血管環單位組織濕重產生的張力(kg/g)作量-效曲線,曲線擬合法求NE的最大反應(Emax)和pD2 (達到50%最大反應時激動劑濃度的負對數-logEC50)，以NE的Emax和pD2 及量-效曲線評價血管對NE的反應性。

將所取SMA血管環掛于注有K-H液中孵育2 h,方法同前,待張力曲線平穩后,換用高鉀液(mmol/L：NaCl 2.7，KCl 120，NaHCO325，KH2PO41.03，MgSO4·7H2O 0.45，葡萄糖11.1，pH 7.4)孵育15 min，待張力曲線平穩后，測定血管環對Ca2+的反應性。按累積濃度法向浴槽高鉀液中依次加入CaCl2，使其終濃度分別為0.03、0.1、0.3、1、2、6、10和30 mmol/L，記錄不同Ca2+濃度下SMA環產生的最大收縮力。以Ca2+濃度和血管環單位組織濕重產生的張力(kg/g)作量-效曲線,曲線擬合法求Ca2+的Emax和pD2，以Ca2+反應的Emax和pD2及量-效曲線評價血管對Ca2+的反應性。

5統計學處理

結 果

1不同IPC方法對失血性休克大鼠24h存活率和存活時間的影響

各組大鼠體重和失血量間無顯著差異(P>0.05)。IPC Ⅰ組存活大鼠為6/10，與休克對照組的3/10和其它預處理組的2/10、4/10相比有顯著差異，且存活時間較休克對照組也明顯延長(P<0.05)。而IPC Ⅱ、Ⅲ組24 h存活率和存活時間與休克對照組相比則無明顯差異(P>0.05)。基于上述結果，我們在后續實驗中選擇的IPC的方法為：夾閉腹主動脈1 min，開放5 min，重復3次,見圖1。

圖1不同IPC方法對失血性休克大鼠24h存活率和存活時間的影響

2IPC對失血性休克大鼠NE升壓效應的影響

2.1IPC對失血性休克大鼠NE升壓效應的影響 隨著休克時間的延長，休克對照組大鼠給予NE后MAP上升幅度明顯下降，與假手術組比較，在休克3 h和4 h，MAP上升幅度分別降至假手術組的36.1% 和24.5%,P<0.01。IPC可明顯增加休克后期NE升壓效應，在休克3 h和4 h，IPC組大鼠給予NE后MAP上升幅度分別為休克對照組的1.84倍和2.19倍,見圖2A。

圖2IPC對失血性休克大鼠NE升壓效應的影響(A)及IPC對在體SMA收縮反應性(B)的影響

2.2IPC對失血性休克大鼠在體SMA對NE收縮反應性的影響 隨著休克時間的延長，失血性休克后大鼠在體SMA對NE的收縮反應性明顯下降，在休克3h和4 h，休克對照組大鼠SMA收縮反應僅為假手術組的20.3%和15.2%；而IPC可明顯改善休克大鼠SMA對NE的收縮反應性，在休克3 h和4 h，IPC組大鼠SMA對NE的收縮反應性分別為休克對照組的2.62倍和3.41倍,見圖2B。

3IPC對失血性休克大鼠血管收縮反應性和鈣敏感性的影響

3.1失血性休克后大鼠離體SMA收縮反應性和鈣敏感性的變化 血管反應性：與正常對照組比較，失血性休克后，腸系膜上動脈血管反應性呈先升高后降低的雙相變化，即休克即刻血管反應性升高，表現為量-效曲線左移，對NE的Emax增加為假手術組的142.3% (P<0.01)。隨著休克時間的延長，血管反應性進行性下降，在休克后3 h和4 h，量-效曲線明顯右移，對NE的Emax顯著降低，分別為假手術組的42.5%和33.3%,P<0.01,見圖3 A、C、E。

圖3失血性休克后血管反應性和鈣敏感性的變化

血管鈣敏感性：與正常對照組比較，失血性休克后，腸系膜上動脈血管鈣敏感性在休克即刻無明顯變化(P>0.05)。隨著休克時間的延長，鈣敏感性逐漸下降，休克30 min、1 h、2 h、3 h、4 h對鈣的Emax分別降低至假手術組的70.4%、70.3%、77.2%、59.5%和57.0% ，P<0.05或P<0.01,見圖3 B、D、F。

3.2IPC對失血性休克大鼠SMA血管反應性和鈣敏感性的影響 在休克早期(休克即刻)，IPC組SMA對NE的收縮反應性和鈣敏感性較失血性休克對照組明顯下降(P<0.05)，但與正常對照組比較無顯著差異(P>0.05)；在休克后期(休克2 h、3 h、4 h)，IPC組SMA對NE的收縮反應性和鈣敏感性較失血性休克對照組顯著增加(P<0.05)，且IPC組SMA的鈣敏感性與正常對照組比較無顯著差異(P>0.05),見圖4。

討 論

預處理是指在暴露于一種短期的應激狀態(缺血、缺氧、熱休克等)及某種生化或藥理試劑后，組織對隨后損傷(如缺血、缺氧性損傷)所獲得的一種保護性反應。大量研究顯示缺血和藥物預處理對心臟、腦、腎臟、骨骼肌、小腸[3-7]等器官的缺血再灌注

圖4IPC對失血性休克大鼠SMA血管反應性和鈣敏感性的影響

損傷有明顯的保護作用，具有一定的器官普遍性。近年來研究發現，IPC和藥物預處理作為一種自我保護機制，可有效防止休克時組織低灌注和組織缺氧所致的休克后器官損傷和功能障礙。但目前關于預處理對失血性休克后血管功能是否有保護作用，尚不清楚。

IPC在其短暫缺血過程中釋放出神經內分泌或旁分泌物質，如腺苷、緩激肽、兒茶酚胺、前列腺素等作用于相應膜受體，這些受體激活后與跨膜G蛋白耦聯，通過不同的胞內信號通路，活化PKC、PKG等，開放線粒體ATP敏感性鉀通道(mKATP)和線粒體鈣激活鉀通道(mBKCa)，關閉線粒體通透性轉換孔(mitochondral permeability transition pore,mPTP)，保護線粒體和細胞功能，發揮預處理保護作用。在對血管的預處理保護研究中發現，對離體的豬冠狀動脈血管環采用缺氧5 min，復氧10 min，重復2次的缺氧預處理方法，可顯著恢復隨后長時間缺氧導致的冠狀動脈內皮依賴性血管舒張反應性及由KCl 誘導血管收縮反應性的損傷[8]。Zhen等[9]也報道了缺氧預處理和KATP通道開放劑KRN4884可以減輕由內皮源性超極化因子介導的血管舒張反應。在本研究中，我們應用不同的IPC方法，觀察失血性休克大鼠24 h存活率和存活時間，結果發現夾閉腹主動脈1 min，開放5 min，重復3次的IPC方法可明顯提高休克大鼠24 h存活率和存活時間。同時在體實驗發現IPC能顯著增加失血性休克大鼠NE的升壓效應和休克大鼠SMA對NE的收縮反應性，在休克3 h和4 h，IPC組大鼠給予NE后MAP上升幅度分別為休克對照組的1.84倍和2.19倍，SMA收縮幅度分別為休克對照組的2.62倍和3.41倍；離體實驗則發現IPC組在休克早期(休克即刻和30 min)血管對NE的收縮反應性明顯低于休克對照組，這可能有助于組織灌注；而在休克中、后期(休克2 h、3 h、4 h)血管反應性明顯高于休克對照組，這些結果均提示IPC誘導了休克后期血管低反應性的保護效應，并可通過改善血管反應性降低休克所致的死亡率。

IPC是如何誘導失血性休克后期血管低反應性保護效應的呢？從休克后血管低反應性的發生機制來看，目前認為除了受體失敏和血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)膜超極化外，休克后VSMCs肌肉收縮蛋白鈣失敏在休克后血管低反應性的發生中也具有重要作用[10]。本研究結果也顯示失血性休克后大鼠SMA鈣敏感性在休克后30 min即出現明顯下降，之后隨著休克時間的延長呈進行性下降。而IPC后休克后期鈣敏感性同血管反應性一樣均較休克對照組明顯升高，提示IPC可能通過恢復鈣敏感性發揮對血管反應性的保護作用。但IPC是如何恢復鈣敏感性，是否與調節鈣敏感性的重要分子Rho激酶、PKC和PKG有關，還有待進一步研究。

我們的實驗顯示IPC后休克后期血管反應性較休克對照組明顯升高，但仍明顯低于正常對照組；而血管鈣敏感性較休克對照組明顯升高，接近正常對照組水平，這提示在休克后期血管反應性下降的發生機制中，除了非鈣依賴性途徑/鈣敏感性途徑外，鈣依賴性途徑調節的血管平滑肌收縮力下降在其中可能也有重要作用。

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《中國病理生理雜志》編輯部

Effectofischemicpreconditioningonvascularreactivityandcalciumsensitivityinhemorrhagicshockrats

HU Yi1, LI Tao2, XU Jing2, TANG Xiao-feng1, LIU Liang-ming2

(1DepartmentofAnesthesiology,2StateKeyLaboratoryofTrauma,BurnsandCombinedInjury,Department2,InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China.E-mail:liangmingliu@yahoo.com)

AIM: To investigate the effect of ischemic preconditioning (IPC) on vascular reactivity and calcium sensitivity during hemorrhagic shock.METHODSAppropriate method of IPC was selected by observing the effect of different strategies of IPC on the survival time and the survival rate in hemorrhagic shock rats. The effect of IPC on the pressor effect of norepinephrine (NE, 3 μg/kg) and the contractile response of superior mesenteric artery (SMA) to NE and calciuminvivoandinvitrowere observed.RESULTSAmong 3 strategies of IPC, 3 cycles of abdominal aorta occlusion for 1 min and loosing for 5 min increased the survival time and 24 h survival rate significantly, which was superior to the other two IPC methods.Invivo, IPC significantly increased the pressor response to NE and the contractile response of SMA to NE (P<0.01).Invitro, IPC significantly improved the reactivity of SMA to NE and Ca2+. The Emaxvalues of SMA to NE and Ca2+in IPC group were significantly higher than that in shock control group (P<0.01).CONCLUSIONIschemic preconditioning reverses Shock-induced vascular hyporeactivity via improving calcium sensitivity of the vasculatures.

Ischemic preconditioning; Shock,hemorrhagic; Vascular reactivity; Calcium sensitivity

R363

A

1000-4718(2011)03-0437-06

2010-08-02

2010-12-17

國家杰出青年基金資助項目(No.30625037)

△通訊作者Tel:023-68757421；E-mail: liangmingliu@yahoo.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.004