HIV-1 p24和SIV p27兩種ELISA試劑盒檢測SIV p27抗原的比較

金 光，王 衛，叢 喆，蔣 虹，陳 霆，魏 強

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

HIV-1 p24和SIV p27兩種ELISA試劑盒檢測SIV p27抗原的比較

金 光，王 衛，叢 喆，蔣 虹，陳 霆，魏 強

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

目的 由于檢測SIV p27抗原試劑盒來源困難，有時不穩定，鑒于HIV-1 p24與SIVp27有較強的交叉抗原，本研究比較HIV-1 p24和SIV p27兩種ELISA試劑盒檢測SIV p27抗原得出的結果是否存在一定的相關性。方法 HIV-1 p24和SIV p27兩種ELISA試劑盒定性和定量檢測樣品中SIV p27抗原，并對檢測結果進行回歸和相關分析。結果 HIV-1 p24和SIV p27兩種ELISA試劑盒檢測SIV p27抗原的靈敏度分別是150 pg/mL和62.5 pg/mL。兩種試劑盒檢測病毒液和血漿中SIV p27抗原的定性結果一致。定量結果的統計分析得出病毒液的直線回歸決定系數R2=0.857，直線相關系數r=0.926，P＜0.01，直線正相關程度較高;血漿的直線回歸決定系數R2=0.512，直線相關系數r=0.716，P＜0.05，直線正相關程度較低。結論 HIV-1 p24 ELISA試劑盒能夠替代SIV p27 ELISA試劑盒定性檢測病毒液和血漿中SIV p27抗原，但只能定量檢測病毒液中SIV p27抗原。

HIV-1 p24;SIV p27

HIV-1 p24抗原和SIV p27抗原分別是HIV-1和SIV的gag基因編碼的高度保守的衣殼蛋白，是HIV-1和SIV的特異性抗原，但兩者在血清學上存在一定程度的交叉反應。目前艾滋病研究中通常使用HIV-1 p24試劑盒檢測HIV-1 p24抗原和SIV p27試劑盒檢測HIV-2及SIV p27抗原［1-5］。雖然也有使用HIV-1 p24試劑盒檢測細胞感染上清中SIV p27抗原報道［6］，這樣可以縮短實驗周期和降低實驗成本，但尚無研究表明兩種ELISA試劑盒檢測結果的關系和這種替代使用的可行性。因此本研究從兩種衣殼蛋白在血清學上的交叉反應出發，比較兩種試劑盒檢測SIV p27抗原的結果的相關性。

1 材料和方法

1.1 病毒株

SIVmac239、SHIV-1157ipd3N4、SHIV-KB9、RTSHIV和SHIVSF162p3通過感染中國恒河猴外周血單核淋巴細胞進行體外擴增，收集感染上清后0.2 μm濾膜過濾，-80℃保存。

1.2 血漿

上述病毒株感染中國恒河猴后，在不同時間采集EDTA抗凝血，分離血漿，-80℃保存。

1.3 血漿病毒RNA載量的測定

TRIzol法提取 EDTA抗凝血漿中病毒 RNA，使用SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR方法測定血漿病毒RNA載量，檢出的最低值為103copies/mL［7］。

1.4 HIV-1 p24 ELISA試劑盒檢測SIV p27抗原

試劑盒 VironostikaHIV-1antigenmicroelisa systemV9(BioMerieux)平衡至室溫，每孔加入25 μL裂解液后加入100 μL陰性對照、標準品和樣品，37℃孵育60 min，洗板 6次，每孔加入100 μL辣根過氧化物酶標記的抗體，37℃孵育60 min，洗板6次，加入底物后室溫避光孵育30 min，終止反應后，酶標儀讀取吸光度值(檢測波長450 nm，參考波長630 nm)。根據得到的吸光度值做出標準曲線并計算樣品中SIV p27抗原的濃度。陰性對照吸光度值+0.07作為臨界值，當吸光度值大于臨界值時判定為陽性，小于臨界值時判定為陰性。

1.5 SIV p27 ELISA試劑盒檢測SIV p27抗原

試劑盒SIV p27 antigen ELISA(ZeptoMetrix Corporation)平衡至室溫，每孔加入25 μL裂解液后加入200 μL陰性對照、標準品和樣品，37℃孵育2 h或過夜，洗板6次，每孔加入100 μL生物素連接的多克隆抗體，37℃孵育60 min，洗板6次，每孔加入100 μL辣根過氧化物酶標記的鏈霉菌抗生物素蛋白，37℃孵育 30 min，洗板 6次，加入底物后室溫避光孵育30 min，終止反應后，酶標儀讀取吸光度值(檢測波長450 nm)。根據得到的吸光度值做出標準曲線并計算樣品中SIV p27抗原的濃度。陰性對照吸光度值+0.05作為臨界值，當吸光度值大于臨界值時判定為陽性，小于臨界值時判定為陰性。

1.6 統計分析

使用SPSS 17.0軟件進行回歸和相關分析［5］。

2 結果

2.1 HIV-1 p24 ELISA試劑盒檢測SIV p27抗原的靈敏度

HIV-1 p24試劑盒定性檢測SIV p27抗原的最低檢出濃度為200 pg/mL，定量檢測的最低檢出濃度為150 pg/mL，更低濃度的抗原判定為陰性或不在標準曲線范圍內。另外，當SIV p27抗原濃度大于等于20 000 pg/mL時，酶標儀讀取的吸光度值達到最大值(3.700)，即 HIV-1 p24試劑盒檢測 SIV p27抗原的濃度范圍是150 pg/mL到20 000 pg/mL。“+”表示定性檢測結果為陽性，“-”表示定性檢測結果為陰性(表1)。

2.2 HIV-1 p24和SIV p27兩種ELISA試劑盒定性檢測SIV p27抗原

兩種試劑盒3次定性檢測的結果一致，病毒液隨著稀釋倍數的升高，逐漸變為陰性。RT-SHIV病毒原液中SIV p27抗原濃度最高而SHIV-KB9病毒原液中濃度最低，這與幾株病毒血漿病毒RNA載量的關系相符。上述幾株病毒液中SHIVSF162p3和 SHIV-KB9為 B亞型，SHIV-1157ipd3N4為C亞型，而除 SHIV-KB9為 CCR5和 CXCR4雙嗜性外，其他都為CCR5嗜性。病毒嗜性的亞型的差異對SIV p27抗原的檢測無明顯影響。“+”表示定性檢測結果為陽性，“-”表示定性檢測結果為陰性(表2)。兩種ELISA試劑盒三次定性檢測不同病毒株感染的血漿中SIV p27抗原的結果一致，血漿病毒RNA載量在5.16×106copies/mL到1.85×108copies/mL范圍內的樣品都為陽性，而血漿病毒RNA載量小于1.19×106copies/mL的樣品都為陰性。“+”表示定性檢測結果為陽性，“-”表示定性檢測結果為陰性(表3)。

2.3 HIV-1 p24和SIV p27兩種ELISA試劑盒定量檢測SIV p27抗原

RT-SHIV病毒液中 SIV p27抗原濃度較高，其他幾株病毒液中濃度較低，兩種試劑盒定量檢測病毒液中SIV p27抗原濃度的高低呈對應關系(圖1)，但血漿中SIV p27抗原濃度的高低并沒有呈現出這種對應關系(圖2)。

使用SPSS 17.0對SIV p27和HIV-1 p24兩種試劑盒得出的SIV p27抗原檢測結果進行回歸分析表明，病毒液：Y=0.031X+0.069，R2=0.859，P ＜0.01;血漿：Y=0.023X，R2=0.512，P ＜0.05(X 代表p27，Y代表 p24)。相關分析表明，病毒液 r=0.926**，P ＜0.01，**表示在0.01 水平(雙側)上顯著相關;血漿 r=0.716*，P ＜0.05，*表示在 0.05水平(雙側)上顯著相關。即兩種試劑盒定量檢測病毒液和血漿中SIV p27抗原的結果呈直線正相關，病毒液呈直線正相關程度較高，血漿的直線正相關程度較低(圖3)。

表1 HIV-1 p24 ELISA試劑盒檢測SIV p27抗原標準品Tab.1 Detection of SIV p27 antigen standard by HIV-1 p24 ELISA kit

表2 SIV p27試劑盒和 HIV-1 p24試劑盒定性檢測病毒液中SIV p27抗原Tab.2 The results of qualitative detection of SIV p27 antigen in the virus stocks by SIV p27 kit and HIV-1 p24 kit

表3 HIV-1 p24 ELISA試劑盒和SIV p27 ELISA試劑盒定性檢測血漿中SIV p27抗原Tab.3 The results of qualitative detection of SIV p27 antigen in the plasma by HIV-1 p24 ELISA kit and SIV p27 ELISA kit

3 討論

雖然HIV-1和HIV-2的基因同源性只有55%～60%，但在血清學反應中，Gag和 Pol蛋白上仍存在一定程度的交叉反應;同時SIVmac和HIV-2的基因同源性接近90%，血清學上也存在一定程度的交叉反應。實際上，HIV-1很可能就是由其他靈長類傳播到人類的［8，9］。由此可以推斷 HIV-1和 SIV的gag區編碼的衣殼蛋白之間在血清學上可能存在一定程度的交叉反應。本研究結果表明確實存在這種交叉反應，HIV-1 p24試劑盒能夠檢測SIV p27抗原，雖然特異性上不如SIV p27試劑盒且靈敏度也略低，檢出的抗原濃度值有一定程度下降，但這種下降有著良好的相關性，并未改變樣品性質，而這種替代卻可以縮短實驗周期和降低實驗成本。

圖1 HIV-1 p24和SIV p27兩種試劑盒定量檢測病毒液中的SIV p27抗原Fig.1 Quantitative detection of SIV p27 antigen in the virus stock by SIV p27 kit and HIV-1 p24 kit

圖2 HIV-1 p24和SIV p27兩種試劑盒定量檢測血漿中的SIV p27抗原Fig.2 Quantitative detection of SIV p27 antigen in the plasma by SIV p27 kit and HIV-1 p24 kit

圖3 HIV-1 p24和SIV p27兩種試劑盒定量檢測病毒液和血漿中SIV p27抗原結果的相關性Fig.3 Correlation between the results of quantitative detection of SIV p27 antigen in the virus stock and plasma by SIV p27 kit and HIV-1 p24 kit

本研究使用HIV-1 p24試劑盒檢測不同濃度的SIV p27抗原標準品以確定其檢測范圍和靈敏度。定性檢測時，當 SIV p27抗原標準品濃度小于200 pg/mL時，不能判定為陽性結果;定量檢測時，當SIV p27抗原標準品濃度小于150 pg/mL時，不能檢出。另外，當 SIV p27抗原標準品濃度大于等于20 000 pg/mL時，讀取的吸光度值達到最大值。即HIV-1 p24試劑盒檢測SIV p27抗原的濃度范圍是150 pg/mL到20 000 pg/mL。此外，本研究使用HIV-1 p24試劑盒檢測有限的幾個血漿樣品得出的SIV p27抗原濃度范圍為0.006到0.029 ng/mL，而使用SIV p27試劑盒得出的范圍為0.06到2.5 ng/mL。而有報道說從 SIVmac感染的血漿中檢出的SIV p27抗原濃度范圍為0.5到7 ng/mL。

兩種試劑盒對病毒液和血漿的定性檢測結果完全一致;而對病毒液和血漿的定量檢測結果進行直線回歸和直線相關分析表明，病毒液直線正相關程度較高而血漿直線正相關程度較低。很顯然血漿中存在一定的干擾因素影響了特異性抗原與抗體的結合，但這種影響并不大，不足以影響樣品性質的判定，但確實降低了抗原定量檢測結果的相關性。與病毒液相比，血漿中含有多種蛋白成份，容易導致非特異性的背景而影響定量檢測結果。另外，由于血漿樣品取自不同的中國恒河猴，個體間的差異和不同采樣時間點的動物狀態差異也會產生一定的影響。本研究選擇了幾種在艾滋病研究中廣泛使用的毒株及其感染血漿進行檢測，雖然幾種毒株的亞型和嗜性不同，但這些毒株都是在SIVmac239克隆株的基礎上直接或間接構建得到的，構建過程中大多數只是對env基因進行替換而沒有改變gag和pol保守區，因此這幾株病毒表達相似的SIV p27核心抗原，這使得我們的實驗結果具有可比性，也可能是病毒液的定量檢測結果具有較高相關性的原因，反之也表明毒株的亞型和嗜性的差異不會影響定量檢測的結果。

值得一提的是，病毒RNA載量的高低與HIV-1 p24或SIV p27抗原的檢出也有一定相關性。有研究表明當病毒RNA載量在105copies/mL以上時，HIV-1 p24試劑盒才能檢出293T轉染細胞上清中SIV p27抗原，且 SIV p27抗原濃度與病毒 RNA載量相關性很好(R2=0.834，P ＜ 0.001)［6］。也有研究表明SIVagm感染的非洲綠猴的血漿病毒RNA載量在107到108copies/mL時能夠檢出約5 ng/mL的SIV p27抗原，血漿病毒 RNA載量在105copies/mL以下時不能檢出 SIV p27抗原。還有結果表明，SIVagm感染的非洲綠猴血漿病毒RNA載量在大于2×105copies/mL時才能檢出 SIV p27抗原。我們使用兩種試劑盒都只能檢出血漿病毒RNA載量在106copies/mL以上的樣品中的 SIV p27抗原，而這樣高的病毒RNA載量只會在感染的急性感染期內一過性出現。由于每個HIV-1或SIV病毒顆粒都含有主要由p24或p27抗原組成的衣殼及殼內包裝的兩個RNA單鏈，這種結構是血漿病毒RNA載量與特異性抗原之間的相關性的基礎。因此，可以進一步研究兩種試劑盒的檢測結果與病毒RNA載量之間的相關性。

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Comparison of the Efficacy of HIV-1 p24 ELISA Kit and SIV p27 ELISA Kit in Detection of SIV p27 Antigen

JIN Guang，WANG Wei，CONG Zhe，JIANG Hong，CHENG Ting，WEI Qiang
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China)

Objective The ELISA kit for HIV-1 p24 is sometimes used for SIV p27 detection.The aim of this study was to eclarify whether there is any dependence and correlation between the results of detecting SIV p27 antigen by HIV-1 p24 ELISA kit and SIV p27 ELISA kit.Methods SIV p27 antigens were detected qualitatively and quantitatively by HIV-1 p24 ELISA kit and SIV p27 ELISA kit，respectively，and the results were compared by regression and correlation analysis.Results The sensitivity of detecting SIV p27 antigen was 150 pg/mL by HIV-1 p24 ELISA kit while 62.5 pg/mL by SIV p27 ELISA kit.The qualitative results obtained by HIV-1 p24 kit consisted with those by SIV p27 kit on detecting SIV p27 antigen in virus stock and plasma.The statistical analysis of quantitative results indicated linear regression R2=0.857，linear correlation r=0.926，P ＜ 0.01 in virus stock，while R2=0.512，r=0.716，P＜0.05 in plasma.The quantitative results turned out to be positive linear regression，which was higher in virus stock and lower inplasma.Conclusions HIV-1 p24 ELISA kit can be used for detecting SIV p27 antigen in virus stock and plasma qualitatively replacing SIV p27 ELISA kit，but quantitatively was appropriate in virus stock only.

HIV-1 p24;SIV p27;Detection;ELISA kit

R33

A

1671-7856(2011)02-0026-05

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.07

2010-09-29

“十一五”國家科技重大專項課題 (2009ZX10004-402，2009ZX10004-307)。

金光，男，碩士研究生，從事實驗動物病毒學研究工作。

魏強，教授，博士生導師，研究方向：實驗動物病毒學。E-mail：weiqiang0430@sohu.com。