貝類毒素監測的動物試驗優化及替代方法

程樹軍，黃 韌，劉慧智

(1.廣東出入境檢驗檢疫技術中心食品實驗室，廣州 510623;2.廣東省實驗動物監測所，廣州 510642)

貝類毒素監測的動物試驗優化及替代方法

程樹軍1，黃 韌2，劉慧智1

(1.廣東出入境檢驗檢疫技術中心食品實驗室，廣州 510623;2.廣東省實驗動物監測所，廣州 510642)

貝類毒素嚴重威脅水產品的質量，而且給人類健康帶來潛在危害。由于其結構多樣、作用機制復雜，貝類毒素監控計劃通常使用動物方法，不僅成本高、定量難，而且不符合“3R”的要求。運用減輕動物痛苦和減少數量的優化方法，開發新的基于毒性作用機制和結構分析的細胞功能檢測法、免疫學方法、化學分析法和生物傳感器方法，這些動物試驗替代方法的研究提高了貝類毒素監測的有效性，經過科學驗證和認可后可用于監控目的。

貝類毒素;動物實驗;替代方法

貝類毒素，也稱海洋生物毒素，主要由藻類或浮游植物產生，蓄積于濾食性軟體貝殼類動物的組織內，例如蚌、扇貝、蛤蚌、牡蠣等，不僅嚴重威脅水產養殖，而且人類食用了受污染的貝類動物會帶來嚴重的健康危害［1］。世界許多國家建立了貝類毒素監控計劃，多數推薦采用經典的動物試驗，這些方法存在明顯的不足和局限，而且不符合3R的原則，因而開發更加敏感、特異、快速和高通量的貝類毒素檢測新技術已成為該領域的重點。

1 貝類毒素分類及基本毒性

根據貝類毒素的化學結構可分為8類，分別是岡田軟海綿酸 (okadaic acid，OA)，扇貝毒素(pectenotoxin，PTX)，石房蛤毒素(saxitoxin，STX)，原多甲藻酸(azaspiracid，AZA)，短裸甲藻毒素(brevetoxin，BTX)，環狀亞胺(cyclic imines)，軟骨藻酸(domoic acid，DA)和蝦夷扇貝毒素(yessotoxin，YTX)。根據毒性作用機制可分為4類，分別是腹瀉性貝毒(DSP)、麻痹性貝毒(PSP)、神經性貝毒(NSP)和遺忘性貝毒(ASP)。STX及其衍生物屬于麻痹類毒素，DA屬于遺忘毒素，腹瀉類貝類毒素包括OA和翅甲藻毒素(DTX)，AZA、PTX和YTX屬于親脂毒素。

腹瀉性貝毒(DSP)可分成三類：聚醚類毒素(如OA和DTX)、大環聚醚內酯毒素(如PTX)和融合聚醚毒素(如YTX)。DSP毒素主要引起腹瀉，通常癥狀不嚴重，對小鼠的半致死量為 LD50為50 μg/kg，但岡田軟海綿酸(OA)是強烈的致癌因子。歐盟2002/225/EC對此類毒素設定了最高限量水平：其中OA/DTX和PTX的總量不能超過160 μg OA eq/kg;YTX及其衍生物不能超過1 mg YTX eq/kg;AZA不能超過160 μg AZA eq/kg。麻痹性貝毒(PSP)大致分為三類：氨基甲酸酯類毒素，包括石房蛤毒素、新石房蛤毒素和膝溝藻毒素(GTX1-4);N-磺酰氨甲酰基類毒素(包括 GTX5、GTX6);脫氨甲酰基類毒素(包括 dcSTX、dcneoSTX、dcGTX1-4)。麻痹性貝毒主要作用是阻斷細胞納離子通道，造成神經系統傳輸障礙而生產麻痹作用。PSP的LD50在(3～10)×10-9μg/kg之間，我國和歐盟均規定上市貝類麻痹性貝毒必須低于800 μg/kg貝肉，相當于4 Mu/g。神經性貝毒(NSP)主要由短裸甲藻產生，目前已分離多達13種毒素，包括BTX-A，B和半短裸甲藻毒素B(hemibrevetoxins B)等。NSP可以引起魚類的大量死亡，人類食用后產生以神經麻痹為主要特征的中毒癥狀。遺忘性貝毒(ASP)的主要成分是軟骨藻酸，它是一種強烈的神經毒性非蛋白氨基酸，能導致短期記憶功能長久損害，LD50為10 μg/kg，2009年，歐盟提出 ASP的允許含量水平為 20 mg DA/kg［2］。

2 貝類毒素監測的動物試驗及優化方法

2.1 經典動物試驗

1937年Sommer等建立了監測PSP的小鼠生物法(MBA法)，MBA法是AOAC和歐盟指令91/492/EEC指定的檢測方法，并且已經使用了50多年，檢測限值近似40 μg STXeq/100 g貝殼組織，是目前最高殘留限量的(MRL)50%。其原理是將待檢樣品的酸性提取液直接進行小鼠腹腔內注射，記錄死亡時間，如果＜5 min，則要稀釋提取物直到死亡時間達到5～7 min。結果用“小鼠單位(MU)”表示，其定義是使一只20 g重的小鼠在腹腔注射后15 min內死亡的毒素含量即為一個鼠單位，而1 Mu的毒素含量相當于0.18 g的 STX(石房蛤毒素)，可以通過乘以轉換系數從小鼠單位MU轉換到μg STX當量，但由于不同品種的小鼠的敏感性不同，這個數值會有波動，實際應用中每個實驗室應建立自己的Mu校正數值。

DSP毒素的MBA檢測法沒有統一的方案，前處理方式(提取溶劑)和檢測樣品(整個生物體或肝胰臟)對檢測效果影響很大。小鼠生物法的最低檢出限量是0.5 Mu/g，換算為 DSP的毒力約為220 μg/kg，報告結果需2 d時間。每個試驗選3只小鼠，腹腔注射5 g HP-eq或25 g WB-eq，如果有兩只死亡可以判定陽性結果。大鼠生物鑒定法(RBA)也可以用來檢測DSP中的OA/DTXs和AZAs。

2.2 動物試驗的優缺點

MBA檢測法相對快速、可靠，在目前還有很多毒素結構未明和機制不清楚的情況下，有可能根據動物出現的異常癥狀檢測未知毒素(如某些親脂毒素)的整體反應，并且無需投入昂貴分析儀器。

動物試驗也有明顯缺點［3］：①檢測樣品鹽度較高干擾測定結果，因而真實毒力水平可能被低估，如對于PSP的檢測，實際毒素濃度范圍可能是檢測結果的1.5～2.5倍;②檢測結果存在實驗室間偏倚，而且無法自動化和高通量;③實驗需要大量高標準實驗動物，以死亡為終點，給動物帶來痛苦;④由于鋅的天然蓄積(尤其是蚌)可能對PSP的檢測存在假陽性［3］;⑤小鼠品系和性別可能對結果有影響;⑥動物實驗與人類的相關性備受質疑，如對于DSP的檢測，動物實驗是用OA/DTXs毒素對小鼠的腹腔注射毒性反映其對人的經口毒性關系，不僅未考慮OA/DTXs等親脂性毒素的其他作用途徑和機制，而且小鼠腹腔毒性與人的經口毒性可能不盡相同;⑦MBA方法檢測親脂毒素缺少專一性，無法區別究竟哪一種毒素導致了毒性效應，因而假陰性和假陽性都會發生。⑧對于DSP的動物實驗方法，不管是小鼠MBA和大鼠RBA試驗均未經過驗證，歐洲標準委員會(CEN)也沒有對貝類毒素檢測的動物試驗制定統一標準，主要是以 Yasumoto開發的DSP毒素檢測方法為基礎建立的，但是即使不同實驗室使用相同方案，也還有許多不同因子影響檢測結果。而且RBA只能用于OA和AZA類毒素的檢測［4］。

2.3 動物實驗優化和減少

Dennison開發了PSP試驗的麻醉小鼠模型，試驗過程中保持小鼠處于麻醉狀態［5］，減輕了動物的痛苦，來自STX的檢測數據表明麻醉可能會增加PSP MBA方法的靈敏度，比知覺模型可靠。

英國貝類毒素國家參考實驗室建立了減少動物數量的方法，將標準規定的動物數量從3只減少到2只，因為從統計分析表明，只使用2只小鼠的實驗可以為超過99%的樣品檢測提供明確的結果。只有在試驗出現1只小鼠死亡1只小鼠存活的情況下，才增加第3只小鼠用于確認。

Asp建議去除 PSP MBA方法中的稀釋步驟使動物數量減少，作者認為沒有必要將高濃度的毒素樣品稀釋，直到小鼠的存活時間在5～7 min范圍內，因為MBA試驗的目的是為了保護消費者免于PSP的傷害，縱使注射未稀釋的高濃度毒素樣品時會降低檢測的精密度，但是只要注射的樣品超過了動物的耐受水平，檢測的精確性并不是那么重要［6］。

3 動物試驗替代方法

3.1 細胞檢測方法

細胞檢測方法的原理是利用貝類毒素與敏感測試系統(細胞成份)的相互作用，通過檢測細胞反應定量檢測毒素水平，細胞檢測法建立在對毒素作用機制充分認識的基礎上。測試系統可以是細胞系統也可以是無細胞系統，但應含有識別毒素的靶分子結構。如石房蛤毒素(STX)和BTX可對Na+通道產生抑制作用，根據這一原理，可以通過檢測STX對毒毛花苷/藜蘆預處理的神經母細胞瘤細胞的存活情況，也可以檢測STX對藜蘆預處理的神經母細胞瘤細胞中膜電位的變化［7］。可用直接比色法、熒光分析或膜電位染色，采用多孔細胞培養板進行高通量檢測［8］。岡田酸(OA)類毒素可特異性抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A)，利用這一機制可開發各種定量檢測方法，檢測極限可達0.2 nmol/L，如采用直接比色、熒光分析和電化學檢測等，測試系統可采用紅細胞(PP2A較敏感)，也可采用無細胞的特異性酶底物(如對氨基苯基磷酸鹽)。扇貝毒素(YTX)素對磷酸二酯酶(PDE)活性具有增強作用，后者直接作用于環磷酸腺苷產生次級反應，基于此機制，建立了以培養的上皮細胞中e-鈣粘蛋白的測量為基礎的PDE活性生物化學分析方法，采用多孔滴定板快速(1 h)熒光分析技術，可應用于大量樣品的篩選［9］。

3.2 免疫學方法

通過制備貝類毒素的抗體，然后檢測抗體與化合物的特異性結合，利用這一免疫學原理可建立檢測貝類毒素的系列試驗，包括酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、橫向流動免疫測定(LFIA)和基于表面等離子體共振的生物傳感器試驗(SPR)。免疫學方法的使用可替代部分動物試驗用于樣品的初篩。因為通常只有在單一毒素存在并且其抗體特異性高的情況下，樣品中毒素濃度的測量與它的毒性直接相關(如DA毒素的檢測)。而在其它情況下，免疫學方法只能用于樣品的篩選或定性方法，不能作為定量方法。

檢測ASP可采用橫向流動免疫色譜法(LFIC)、ELISA法和SPR生物傳感器技術。檢測石房蛤毒素(STX)可采用抗體法和受體錨定法2種方法，其中側向橫流免疫色譜(LFIC)的標準化試劑盒已完成協作試驗，有望通過 AOAC的認可。采用這類LFIC試劑盒(如 MIST AlertTM)檢測 PSP，可以在不到20 mim時間內得到40 μg/100 g的檢測極限，非常方便現場試驗和終產品檢測。神經性貝毒(NSP)的檢測目前已有ELISA方法檢測短祼甲藻毒素，并被美國官方認可。

3.3 化學分析方法

以液相色譜(LC)分離原樣或凈提取物為基礎，然后用物理化學方法進行特異性毒素檢測，例如用紫外線(LC-UV)、熒光法(LC-FL)或質譜分析法(LC-MS)檢測毒素，這樣完全不使用動物就可實現毒素的定量檢測。2007年，采用超高壓液相色譜(VHPLC)-MS/MS檢測法實現了僅用6.6 min分析21種親脂類毒素［10］，借助于靈敏度不斷提高的檢測設備，更快速和高通量的檢測方法有望不斷建立。由于這些方法對化合物檢測的特異性，化合物中單一物質的單獨濃度的原始數據必須用轉換因子轉換成毒素當量。化學方法是目前歐盟等法規檢測貝類毒素的定量分析方法(如 HPLC檢測ASP)，缺點是需要高純度標準品，而對于大多數毒素，合成或提純標準品非常困難。

3.4 生物傳感器方法

在對毒素作用機制充分了解的基礎上，以生物化學和傳感技術為基礎建立生物傳感器方法，利用生物活性物質(如酶、抗體、抗原、細胞等)作識別元件，配以適當的物理或化學信號轉換器所構成的分析工具。這項技術適用于貝類毒素的高通量的快速檢測，如利用 OA類毒素對蛋白磷酸酶2A(PP2A)產生特異性抑制作用的特點，Campas等2007年開發了一種用于OA的電化學檢測酶傳感器，這種傳感器建立在固定該毒素的PP2A酶的抑制作用和由酶引起脫磷酸化作用之后才具有電化學活性的酶基質的基礎上［11］。使用石英晶體微天平(QCM)來測定 OA，采用直接競爭法結合化學發光檢測技術以提高檢測的靈敏度。對于神經性貝毒(NSP)檢測的檢測也有類似的方法，如利用PbTx-3對胞外動作電位的效應，開發神經元網絡生物傳感器檢測PbTx-3，檢測限在緩沖溶液中為296 pg/mL，在稀釋25倍的海水中為430 pg/mL。

表1 貝類毒素監測的動物試驗及替代方法Tab.1 Animal testing and alternative methods for shellfish toxins monitoring

4 前景展望

近年來，以歐洲食品安全局為代表的機構投入了大量資金用于貝類毒素檢測方法的研發，許多具有前景的非整體動物的替代方法被提出或進入驗證階段(表 1)［3］。

目前歐洲標準委員會(CEN)完成標準化的貝類毒素分析方法主要是以液相色譜技術為基礎的化學分析法，如檢測貝類 DA毒素的LC-UV方法，檢測貝殼類OA毒素的前置柱衍生作用加熒光檢測的LC-FL方法，檢測貝殼類STX和dc-STX毒素的前置柱衍生作用加熒光檢測的LC-FL方法，檢測貝殼類OA毒素的有后置柱衍生作用加熒光檢測的LC-方法等。然而由于動物試驗的準確性和差異性等方面的局限，雖然監管部門都將MBA方法列為監測計劃的檢測方法，但CEN沒有對貝類毒素檢測的動物試驗制訂統一標準。

顯然，尋找替代動物試驗的方法仍是貝類毒素監控檢測技術研發的熱點，雖然已有一些替代方法被推薦作為食品法典委員會的參照方法或被官方認可用于監管目的，但仍有許多問題需要解決，如大多數細胞檢測法或化學分析法只能針對某一特定類別毒素的分析，使其應用范圍受到一定限制;免疫學方法雖然能進行多樣品的同時檢測，但靈敏度和檢測限還不能滿足監控要求;替代方法的穩定性仍有待進一步驗證，生物傳感器方法中生物識別元件的再生及可重復利用問題并未得到根本解決［12］。隨著貝類毒素作用機制了深入了解和檢測技術的進步，在3R原則的推動下，很多替代動物實驗的方法應用于海洋產品的質量檢測和納入生態環境監控計劃是非常有前景的。

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Optimization of Animal Testing and Alternative Methods for Shellfish Toxin Monitoring

CHENG Shu-jun1，HUANG Ren2，LIU Hui-zhi1
(1.Food Lab of Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Technology Center，Guangzhou 510623，China;2.Guangdong Laboratory Animal Monitoring Institute，Guangzhou 510620)

Objective Shellfish toxins are not only threatening to quality of marine aquatic products but also become a potential threat to human health.As the structure diversity and function mechanism complexity，the monitoring programs of shellfish toxins using animal models are costly，difficult to quantitate and not meet 3R principles.There is a pressing need to develop new methods to reduce quantity of used animals and to relieve animal distress.Recently，many new assays based on action mechanisms have been developed including functional，immunological，chemical analysis and biosensor methods.These methods promote the efficacy of shellfish toxin monitoring，and will be accepted by administration for regulation programs provided these approaches be scientifically validated and standardized.

Shellfish toxin，monitoring;Animal test;Alternative method

R185;R332

A

1671-7856(2011)02-0051-05

2010-09-20

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.12

廣東省科技計劃項目(2009B060300013)。

程樹軍(1971)，男，副研究員，碩士生導師，研究方向：動物試驗替代方法及標準化。