奧司他韋、利巴韋林和鹽酸金剛乙胺對甲型H1N1流感病毒的抑制作用

蔣 虹，金 光，叢 喆，鮑琳琳，秦 川，魏 強

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

奧司他韋、利巴韋林和鹽酸金剛乙胺對甲型H1N1流感病毒的抑制作用

蔣 虹，金 光，叢 喆，鮑琳琳，秦 川，魏 強

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

目的 細胞水平測試奧司他韋、利巴韋林和鹽酸金剛乙胺對甲型流感H1N1病毒的抑制或殺傷作用。方法 通過在MDCK細胞系和甲型H1N1病毒株間建立藥物劑量-效應關系確定導致細胞死亡的效力與抑制病毒復制的效力的比值(治療指數)，測試藥物的抗病毒效果。結果 奧司他韋、利巴韋林和鹽酸金剛乙胺對MDCK細胞的半數中毒濃度分別為(1134.7±186.8)μg/mL、(742.0±76.9)μg/mL、(94.6±1.9)μg/mL，對甲型H1N1病毒的治療指數(TI)分別為71.19、24.9和3.12。結論 奧司他韋對甲型H1N1病毒抑制作用最強，利巴韋林其次，鹽酸金剛乙胺對甲型H1N1病毒抑制效果較弱。

病毒，甲型H1N1;奧司他韋;利巴韋林;鹽酸金剛乙胺

奧司他韋(oseltamivir)別名：達菲是特異性抑制神經氨酸酶的活性，阻止病毒顆粒釋放的一種最有效的抗流感病毒的藥物，2002年下半年在中國上市，已廣泛應用于臨床治療［1］?？共《净衔锢晚f林(ribavirin)又名病毒唑，是單磷酸次黃嘌呤核苷(IMP)脫氫酶抑制劑，抑制IMP而阻礙病毒核酸合成的廣譜強效的抗病毒藥物［2］。鹽酸金剛乙胺(rimantadine hydrochloride)為治療和預防病毒性感冒的一線用藥，對于流感的預防與早期治療均有明顯的效果［3］。但 2009年暴發“人感染豬流感”疫情，此次疫情的病原為變異后的新型甲型H1N1流感病毒，目前已在人類感染者體內發生變異，變異后的病毒對流感藥物產生了明顯的抗藥性。世衛組織在09年7月首次收到關于大流行性流感病毒對奧司他韋具有耐藥性的報告。隨著世界許多地區流感活動增加［4］，以及抗病毒藥物的使用亦相應增多，這些事件的數量也在穩步增加。甲型H1N1A/California/7/09 病毒株［5，6］是 2009 年多區域檢測到的動物源性的能夠人與人傳播的病毒株，我們選擇奧司他韋、利巴韋林和鹽酸金剛乙胺3種藥物對甲型H1N1A/California/7/09體外抑制作用進行測試，對藥物的抗病毒作用有一基本了解。

1 材料和方法

1.1 細胞和病毒

MDCK細胞(Madin Darby canine kidney)由中國醫學科學院病原生物學研究所提供，細胞生長為含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、100 U青鏈霉素的DMEM(Hyclone)培養液。

甲型H1N1-CA7(A/California/7/09)病毒，雞胚尿囊液［7］。用 MDCK細胞擴增培養，維持液為DMEM培養液(Hyclone)含2%胎牛血清(Gbico)和終濃度 2 μg/mL TPCK。病毒半數細胞感染劑量(TCID50)為6.5。所有病毒操作在中國醫學科學院醫學實驗動物研究所生物安全三級(ABSL-3)實驗室進行。

1.2 測試藥物

奧司他韋(達菲)，批號090336，上海藥物所提供。利巴韋林，四川百利藥業有限責任公司提供。鹽酸金剛乙胺，批號 Ky-Ru-MHA01，浙江普洛康制藥有限公司提供。用維持液配制藥物至5 μg/mL，作為藥物毒性實驗的起始濃度。0.2 μm濾器過濾除菌。

1.3 病毒滴定

甲型H1N1病毒接種于MDCK細胞96孔培養板中，34℃ 5%CO2培養3 d后觀察細胞病變。棄上清液加入100 μL 0.5%中性紅(Sigma)，37℃避光作用1 h，PBS洗滌3次，每孔加入100 μL乙酸乙醇(1%乙酸50%乙醇)酶標儀540 nm讀取吸光度值，計算病毒的半數感染劑量(TCID50)［8］。

1.4 藥物對MDCK細胞毒性實驗

藥物毒性實驗的起始濃度5 μg/mL，2倍系列稀釋藥物，加入到單層 MDCK細胞96孔培養板，37℃ 5%CO2培養，每天觀察細胞病變。第5天培養板中加入CCK-8(同仁化學研究所公司)，每孔10 μL，將培養板放于37℃ 5%CO2孵箱中3 h。酶標儀讀板測定吸光度值波長為540 nm。按 Reed Muench計算藥物對細胞的毒性濃度，最大無毒濃度(TD0)，半數中毒濃度(TD50)。

1.5 藥物抗病毒實驗

長成單層的 MDCK細胞96孔培養板中，加入100 TCID50病毒，37℃ 5%CO2吸附 2 h，吸去病毒，受試藥物用無血清DMEM培養基配制，從最大安全濃度起始 2倍系列稀釋，加入到板中，34℃、5%CO2培養 3 d，觀察細胞病變。去上清液，加入0.5% 中性紅，每孔 100 μL，37℃ 5%CO2作用 1 h。棄去中性紅，PBS(PH 7.2)洗滌3次，棄去96孔培養板中液體，加入乙酸乙醇(1%乙酸50%乙醇)，每孔100 μL，室溫放置15 min，540 nm 測定 A值。計算藥物抑制病毒半數有效濃度(IC50)。

1.6 評價指標

藥物對病毒的抑制率的曲線、藥物對細胞50%毒性濃度與對病毒50%抑制濃度的比值(TC50/IC50)即治療指數(therapeutic index，TI)［9，10］。

2 結果

2.1 藥物毒性

根據藥物對MDCK細胞破壞率計算出藥物半數中毒濃度和藥物的安全濃度，奧司他韋、利巴韋林和鹽酸金剛乙胺的半數中毒濃度分別為(1134.7±186.8) μg/mL、(742.0 ±76.9)μg/mL、(94.6 ±1.9)μg/mL(表1)對細胞的安全濃度分別為156.3 μg/mL 、78.1 μg/mL 、39.1 μg/mL。

2.2 藥物對甲型H1N1病毒的抑制作用

奧司他韋、利巴韋林和鹽酸金剛乙胺與100 TCID50甲型H1N1病毒作用，用細胞觀察法和中性紅測試細胞活性的方法獲得藥物對病毒的抑制率(圖1)和藥物抑制病毒半數有效濃度(IC50)(表1)。奧司他韋藥物在對 MDCK細胞的安全濃度(156.3～19.5)μg/mL對病毒的抑制率達到80%以上，隨后濃度到4.88 μg/mL仍有20%的抑制作用，治療指數為71.19。利巴韋林濃度在(78.13～4.88)μg/mL之間對病毒的抑制作用80%逐漸遞減，治療指數為24.90。鹽酸金剛乙胺對病毒的抑制率只有在濃度為78.3 μg/mL時達到50%，治療指數為3.12。

圖1 藥物對甲型H1N1-CA7病毒的抑制率(A)奧司他韋、(B)利巴韋林、(C)鹽酸金剛乙胺Fig.1 The inhibition rate of influenza A(H1N1)virus.(A)Oseltamivir phosphate，(B)Ribavirin，(C)Rimantadine hydrochloride

表1 藥物對甲型H1N1病毒的抑制作用Tab.1 The inhibitory effects of compounds on H1N1-CA7 virus infection

3 討論

三種藥物對甲型 H1N1A/California/7/09病毒株在細胞水平抑制病毒的作用測試結果表明，奧司他韋抑制病毒作用強，治療指數、安全性高。據報道，奧司他韋抑制神經氨酸酶的活性，具有特異性針對流感病毒釋放的功效，體外實驗證實與抗病毒類藥物如利巴韋林、鹽酸金剛乙胺相比，顯示出明顯的優勢。雖然利巴韋林對甲型H1N1A病毒也有一定的抑制作用，但效果不如奧司他韋。鹽酸金剛乙胺對甲型H1N1A病毒抑制效果較弱。三種藥物通過細胞水平測試得到以上結果，但實際在人體內、動物體內的抗病毒作用因藥物代謝作用不得而知，還應進行深入研究。

［1］ Dharan NJ;Gubareva LV;Meyer JJ，et al.Infection with oseltamivir-resistant influenza A(H1N1)virus in the United States［J］.JAMA，2009，301(10)：1034-1041.

［2］ Eriksson B，Helgstrand E，Johansson NG，et al.Inhibition of influenza virus riboncleic acid polymerase by ribavirin triphosphate［J］.Antimicrob Agents Chemoth，1977，p.946-951.

［3］ 高長有.鹽酸金剛乙胺防止流行性感冒的療效分析［J］.臨床心身疾病雜志，2007，13(5)：442.

［4］ Rohloff J C，Kent K M，Postich M J，et al.Practical total synthesis of the anti-influenza drug GS-4104［J］.Org Chem，1998，63(13) ：4545-4550.

［5］ Neumann G，Noda T，Kawaoka Y.Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus［J］.Nature，2009，459：931-939.

［6］ Soundararajan V， Tharakaraman K， Raman R， et al.Extrapolating from sequence—the 2009 H1N1“swine”influenza virus［J］.Nat Biotechnol.2009，27：510-513.

［7］ Chen Z，Wang W，Zhou H，et al.Generation of live attenuated novel influenza virus A/California/7/09(H1N1)vaccines with high yield in embryonated chicken eggs［J］.J Virol.2010，84(1)：44-51.

［8］ 黃禎祥.醫學病毒學基礎及實驗技術［M］.北京科學出版社.1990：661-693.

［9］ 新藥(西藥)臨床及臨床前研究指導原則［S］.中國人民共和國衛生部藥政局.1993：170-171.

［10］ 國家食品藥品監督管理局國家藥品標準［S］.WS1-(X-251)-2004Z.

Antiviral Activity of Oseltamivir Phosphate，Ribavirin and Rimantadine Hydrochloride on Influenza A/H1N1 Virus in Vitro

JIANG Hong，JIN Guang，CONG Zhe，BAO Lin-lin，QIN Chuan，WEI Qiang
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China)

Objective To evaluate the antiviral activity of oseltamivir phosphate，ribavirin and rimantadine hydrochloride on influenza A(H1N1)in vitro.Methods Drugs diluted in FCS-free DMEM media supplemented with 2 μg/mL TPCK-treated trypsin was applied to confluent MDCK cell monolayers for 1 h prior to addition of virus，at a challenge dose of one hundred times of the TCID50.The IC50of drugs were calculated using neutral red assay after 3 days treatment at 34℃.Results The therapeutic index(TI)of oseltamivir phosphate against influenza A(H1N1)virus was 61.90，ribavirin was 42.86，and rimantadine hydrochloride was 6.22.Ubenimex was lower than 1.00.Conclusions Influenza virus is sensitive to oseltamivir phosphate and ribavirin.The antiviral effect of rimantadine hydrochloride is significantly lower than that of oseltamivir phosphate and ribavirin.

Influenza A(H1N1)virus;Oseltamivir phosphate;Ribavirin;Rimantadine Hydrochloride

R33

A

1671-7856(2011)02-0023-03

2010-09-27

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.06

北京市科技計劃課題，編號：Z09000700090904。

蔣虹，女，研究方向：實驗病毒學。

魏強，男，教授，博士生導師，研究方向：病毒學。