SHIV1157ipd3N4細胞適應株的制備及其生物特性

叢 喆，姚 南，劉 浩，金 光，陶 真，陳 霆，魏 強

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

SHIV1157ipd3N4細胞適應株的制備及其生物特性

叢 喆，姚 南，劉 浩，金 光，陶 真，陳 霆，魏 強

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

目的 體外制備SHIV1157ipd3N4病毒中國恒河猴細胞適應株，在細胞水平和中國恒河猴體內(nèi)評價其生物學特性。方法 用SHIV1157ipd3N4病毒陰道感染中國恒河猴，在血漿病毒載量高峰期采血分離外周血單核淋巴細胞(PBMCs)，與正常中國恒河猴PBMCs共培養(yǎng)。定期測定培養(yǎng)液中的P24抗原水平。當病毒復制達高峰期時收集培養(yǎng)上清，分裝并凍存。測定病毒RNA載量、P24抗原濃度和TCID50。靜脈感染中國恒河猴，研究該批次SHIV1157ipd3N4在體內(nèi)的病毒學、免疫學指標變化及變異情況，分析其基本的生物學特性。結(jié)果 本研究共制備了243 mL SHIV1157ipd3N4病毒原液，gp120序列分析表明病毒未發(fā)生變異，CCR5的嗜性也未發(fā)生改變。病毒載量為1.586×108copies/mL，P24抗原水平為1.16×103pg/mL，TZM-bl細胞測定病毒的 TCID50為3.16×103/mL。1 mL SHIV1157ipd3N4靜脈成功感染中國恒河猴G1004V，高峰期病毒載量達到1.0×106copies/mL以上。結(jié)論 此次制備的SHIV1157ipd3N4細胞適應株生物學特性穩(wěn)定，適合作為毒種庫構(gòu)建SHIV1157ipd3N4/中國恒河猴模型。

SHIV1157ipd3N4;CCR5嗜性;中國恒河猴;外周血單核淋巴細胞;半數(shù)感染量

R5-SHIV1157i是由美國 Dana-Farber Cancer研究所 Ruth Ruprecht教授實驗室由一名贊比亞6個月大的嬰兒身上分離的致病株，經(jīng)一系列動物體內(nèi)傳代和基因改造，制備出具有高致病能力的 CCR5嗜性的 C亞型強毒株 SHIV1157ipd3N4［1-4］。本研究擬利用中國恒河猴PBMCs一次性大量制備SHIV1157ipd3N4細胞適應株，建立相應的病毒庫，了解其生物學特性，以期在今后的艾滋病疫苗和藥物評價中加以應用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

恒河猴2只(0705046和G1004V)，購自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所(一級動物，合格證編號：SCXK(京)2005-0005)，用商品化膨化飼料飼養(yǎng)，體重3 Kg。實驗前經(jīng)體檢無異常，經(jīng)血清學間接免疫熒光抗體檢查法(IFA)檢查排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄 D 型病毒(SRV-1，2，5)和猴 T淋巴細胞性I型病毒(STLV-1)的感染。

1.2 SHIV1157ipd3N4

由美國 Dana-FarberCancer研究所 Ruth Ruprecht教授惠贈。中國恒河猴 PBMCs細胞滴定TCID50為1×103/mL，10～20 TCID50/mL 連續(xù)陰道感染中國恒河猴0705046。

1.3 SHIV1157ipd3N4病毒的分離與細胞適應株的大量制備［5］

SHIV1157ipd3N4病毒感染中國恒河猴0705046后，定期采集 EDTA抗凝全血，分離血漿提取病毒RNA，Real-time RT-PCR方法檢測血漿病毒載量。當病毒載量達到高峰期時，取血分離外周血單核淋巴細胞，進行CD8+T細胞敲除，剩余的CD8-T細胞加入含 SEB(0.5 μg/mL)、IL-2(50 U/mL)、丙酮酸鈉、非必需氨基酸的1640生長液，5%CO2、37℃培養(yǎng)。3 d后，與同樣處理的正常猴CD8-T細胞按1∶1比例混合共培養(yǎng)。每隔2～3 d測定上清液中P24抗原濃度。根據(jù)細胞生長狀態(tài)適時更換添加培養(yǎng)基和新的 PBMCs細胞，以維持細胞的正常生長狀態(tài)。當上清液中P24抗原濃度大于1 ng/mL時收集病毒，分裝，液氮保存。

1.4 SHIV1157ipd3N4細胞適應株 gp120序列擴增及測序［6］

使用Takara One Step RNA PCR Kit(大連寶生物，DRR024A)擴增病毒env區(qū)6210-7846間長度為1636 bp的序列，PCR產(chǎn)物切膠回收純化后測序，進行序列分析。

1.5 SHIV1157ipd3N4細胞適應株病毒學指標的測定

將SHIV1157ipd3N4病毒原液10倍梯度稀釋，用 HIV-1 Antigen microelisa system”(Biomerieux，284033)測定病毒液P24抗原濃度。用TZM-bl細胞滴定SHIVSF162P3病毒的 TCID50，三次滴定的結(jié)果取平均值作為最終的TCID［7］50。取病毒液200 μL，TRIzol法提取病毒RNA，SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR法測定病毒RNA載量［8］。

1.6 SHIV1157ipd3N4細胞適應株生物學特性的恒河猴體內(nèi)評價

SHIV1157ipd3N4細胞適應株1 mL靜脈感染中國恒河猴G1004V，定期采集 EDTA抗凝全血，realtime RT-PCR方法檢測血漿病毒載量，測定外周血CD4+/CD8+和CD4+T淋巴細胞絕對數(shù)。

圖1 SHIV 1157ipd3N4病毒陰道途徑感染猴0705046血漿病毒載量結(jié)果Fig.1 Changes of the viral load in plasma of SHIV1157ipd3N4-inoculated rhesus monkeys intravaginally

2 結(jié)果

2.1 SHIV1157ipd3N4陰道感染猴0705046血漿病毒載量的結(jié)果

感染猴0705046在感染后11 d血漿病毒載量呈陽性，19 d達到2.151×107copies/mL。22 d采集EDTA抗凝血9 mL，分離PBMCs。22 d的血漿病毒載量為1.321×106copies/mL。

2.2 SHIV1157ipd3N4病毒細胞適應株的大量制備

感染猴和正常猴CD8-T細胞刺激3 d后合并培養(yǎng)。整個傳代過程中PBMCs生長狀態(tài)良好，經(jīng)SEB刺激出現(xiàn)明顯的增殖成團現(xiàn)象。在合并后7 d傳代并添加新的刺激好的正常猴PBMCs，偶見少數(shù)體積較小的融合細胞(圖2)。合并后9 d收集病毒液243 mL。最終測定P24抗原濃度為1.16×103pg/mL，病毒載量為 1.586 ×108copies/mL，TZM-bl細胞滴定 TCID50為3.16×103/mL。

2.3 SHIV1157ipd3N4細胞適應株env基因序列測定

巢氏RT-PCR擴增SHIV1157ipd3N4細胞適應株的env基因gp120序列，BioEdit軟件分析發(fā)現(xiàn)與SHIV1157ipd3N4序列(DQ779174.1)相似度為99%。在7100 bp有一個腺嘌呤“A”插入，7277 bp處胞嘧啶“C”變成腺嘌呤“A”。經(jīng) Env區(qū)序列對應的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)沒有引起氨基酸序列的改變及糖基化位點的改變，V3區(qū)頂端四肽沒有改變。

2.4 SHIV1157ipd3N4細胞適應株感染猴G1004V血漿病毒載量、CD4+/CD8+及CD4絕對數(shù)結(jié)果

SHIV1157ipd3N4細胞適應株感染猴G1004V感染后7 d即檢測到較強的血漿病毒載量，并且從10 d到21 d一直維持在1.0×106copies/mL以上，隨后迅速下降，28d已降至8.2×104copies/mL，直至96 d再未檢測到。伴隨著載量的高峰，G1004V在感染后10 d起CD4+/CD8+有一個大幅下降，從2.15降至0.78，隨后緩慢上升。與此同時，CD4+T細胞絕對數(shù)在這個階段也有一個下降，維持在600～800個/mL之間(圖3)。

圖2 正常及接種SHIV1157ipd3N4病毒的猴PBMCs細胞細胞形態(tài)變化Fig.2 Changes of the PBMCs from normal Chinese-origin rhesus monkeys and monkeys after SHIV1157ipd3N4 infection

圖3 SHIV1157ipd3N4感染恒河猴后外周血病毒載量、CD4+/CD8+和CD4+T細胞絕對數(shù)變化趨勢Fig.3 The changes of viral loads，CD4+/CD8+and absolute CD4+T cells in peripheral blood after SHIV1157ipd3N4 infection

3 討論

人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)C亞型是世界上流行的HIV主要亞型，大約導致了世界上50%以上的感染。目前大多數(shù)SHIV毒株所利用的env基因都源自HIV-1 B亞型，因此現(xiàn)有的SHIV病毒并沒有反應出當前HIV-1流行趨勢。另外，世界上超過90%的HIV感染與黏膜傳播有關，包括性傳播和母嬰傳播［9］。因此一株能夠通過黏膜傳播的帶有HIV-1 C亞型env區(qū)的SHIV病毒是研究HIV感染和發(fā)病機制及評價AIDS候選疫苗功效所需要的。

R.M.Ruprecht小組從一個6個月大的贊比亞嬰兒身上分離并構(gòu)建的SHIV-1157i及其傳代病毒SHIV1157ipd3N4是具有高度復制能力的、CCR5受體嗜性、經(jīng)黏膜傳播的帶有HIV-1 C亞型 env區(qū)的SHIV株，成功地通過黏膜途徑感染恒河猴和豬尾猴并誘發(fā)AIDS，尤其在恒河猴體內(nèi)緩慢的發(fā)病進程與人類感染 HIV-1相似。因此，SHIV-1157i及SHIV1157ipd3N4感染的恒河猴模型對研究人類HIV感染的發(fā)病機制和研究以env區(qū)為目標的AIDS疫苗具有重要意義。

本研究采用磁性細胞分選等技術(shù)首次制備了大批量的SHIV1157ipd3N4中國恒河猴PBMC細胞適應株。TZM-bl細胞滴定 TCID50為 3.16×103/mL，中國恒河猴 PBMCs細胞滴定 TCID50為5×102/mL，相比 R. M. Ruprecht教授提供的SHIV1157ipd3N4的TCID50略低，尤其是 TZM-bl細胞滴定的結(jié)果更是低了接近100倍。由于R.M.Ruprecht教授使用印度恒河猴進行病毒的傳代及擴增，一直以來國際上也公認印度恒河猴比中國恒河猴對SIV/SHIV的敏感性更高，反應更強，我們的結(jié)果更證實了這一點［10］。本研究中，SHIV1157ipd3N4經(jīng)過中國恒河猴猴體的感染和猴 PBMCs的擴增，env基因gp120區(qū)段堿基沒有發(fā)生明顯變異，對應的氨基酸序列也同樣沒有改變，SHIV1157ipd3N4中國恒河猴適應株依然保持CCR5單嗜性。多次傳代后這一特性并沒有發(fā)生突變或丟失證明了SHIV1157ipd3N4在中國恒河猴猴體內(nèi)的穩(wěn)定性。本批次SHIV1157ipd3N4靜脈途徑成功感染中國恒河猴，出現(xiàn)規(guī)律的血漿病毒血癥，高峰期載量達到106copies/mL以上。但外周血CD4+/CD8+沒有顯著的下降，CD4+T細胞絕對數(shù)沒有明顯的變化，這些與國外的報道是一致的。

目前為止，SHIV 1157ipd3N4毒株是第一例報道的CCR5單噬性的C亞型強毒株。通過中國恒河猴PBMCs體外傳代過程使之獲得了在中國恒河猴體內(nèi)的適應能力，同時SHIV1157ipd3N4的CCR5嗜性和黏膜感染特點使其成為研究C亞型HIV-1流行株黏膜途徑感染機制的理想模型。本研究中制備的SHIV1157ipd3N4細胞適應株生物學特性穩(wěn)定，適合作為毒種庫構(gòu)建 SHIV1157ipd3N4/中國恒河猴模型，在今后C亞型疫苗的評價中必將發(fā)揮重要的作用。

［1 ］ Song RJ，Chenine AL，.Rasmussen RA，et al.Molecularly cloned SHIV-1157ipd3N4： a highly replication competent，mucosally transmissible R5 simian-human immunodeficiency virus encoding HIV Clade C env［J］.J Virol，2006，80(17)：8729-8738.

［2］ Humbert M，Rasmussen RA，Song RJ，et al.SHIV-1157i and passaged progeny viruses encoding R5 HIV-1 clade C env cause AIDS in rhesus monkeys［J］.Retrovirology，2008，5：94.

［3 ］ On Ho，Kay Larsen，Patricia Polacino，et al.Pathogenic infection of Macaca nemestrina with a CCR5-tropic subtype-C simianhuman immunodeficiency virus［J］.Retrovirology，2009，6：65.

［4］ Rasmussen RA，Ong H，Song RJ，et al.Efficacy of a multigenic protein vaccine containing multimeric HIV gp160 against heterologous SHIV clade C challenges［J］.AIDS，2007，21(14)：1841-1848.

［5］ 劉浩，劉強，叢喆，等.模擬HIV性傳播特點的SIVmac239中國恒河猴直腸黏膜感染研究［J］.中國實驗動物學報，2006，14(4)：271-275.

［6］ Liu Q，Yang GB，Ma Y，et al.Sequence variation in the Gp120 region of SHIV-CN97001 during in vivo passaging［J］.Virol Sinica，2008，23(1)：8-14.

［7］ Li M，Gao F，Mascola JR，et al.Human immunodeficiency virus type 1 env clones from acute and early subtype B infections for standardized assessments of vaccine-elicited neutralizing antibodies［J］.J Virology，2005，10108-10125.

［8］ 叢喆，李兆忠，魏強，等.SYBR GreenⅠ實時熒光定量 RTPCR測定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷貝數(shù)方法的建立［J］. 中國實驗動物學報，2006，14(4)：271-275.

［9］ Pope M，Haase AT.Transmission，acute HIV-1 infection and the quest for strategies to prevent infection［J］.Nat Med，2003，9(7)：847-852.

［10］ Ling B，Veazey RS，Penedo C，et al.Longitudinal follow up of SIVmac pathogenesis in rhesus macaques of Chinese origin：emergence of B cell lymphoma［J］，2002，31(4-5)：154-163.

Propagation and Characterization of SHIV1157ipd3N4 Adaptive Virus Stock in Chinese-Origin Rhesus Macaques

CONG Zhe，YAO Nan，LIU Hao，JIN Guang，TAO Zhen，CHEN Ting，WEI Qiang
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China)

Objective To propagate SHIV1157ipd3N4 virus stock via passages in Chinese-origin monkey peripheral blood mononuclear cells(PMBCs).Methods The PBMCs from Chinese-origin rhesus macaque were cocultured with SHIV1157ipd3N4，a CCR5-tropic chimeric simian-human immunodeficiency virus(SHIV)strain.The level of P24 antigen in the supernatant was tested continuously.The virus stock was collected when the viral duplication reached a peak.The env gene of SHIV1157ipd3N4 was analyzed，and the viral load，P24 antigen level and TCID50were determined.The rhesus monkey G1004V was infected with this batch of SHIV1157ipd3N4 intravenously.The viral load in plasma and the changes of CD4+/CD8+ratio were analyzed by real-time RT-PCR and flow cytometry.Results Totally 243 mL virus stock was propagated in monkeys PBMCs.The viral load was 1.586×108copies/mL，the level of P24 antigen was 1.16×103pg/mL and had 3.16×10350%tissue culture infective dose(TCID50)in 1 mL of cell-free SHIV1157ipd3N4.There was no variation in the gp120 sequence of env gene and this SHIV1157ipd3N4 stock was still exclusively CCR5-tropic.The monkey G1004V was infectedand had a high level of viral loads in plasma.Conclusion This panel of pathogenic R5-tropic SHIV1-157ipd3N4 was adapted in Chinese-origin rhesus monkeys PBMCs，and is stable and suitable to serve as an animal model.

SHIV1157ipd3N4;CCR5-Specifc;Chinese-origin rhesus monkeys;PBMCs;TCID50

R373;R33

A

1671-7856(2011)02-0012-04

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.03

2010-10-18

國家十一五科技重大專項課題 (2009ZX10004-402，2008ZX10001-015-10)。

叢喆，碩士，主管技師，從事實驗動物病毒分子生物學和模型研究工作。

魏強，教授，博士導師，研究方向：實驗動物病毒學。E-mail：weiqiang0430@sohu.com。