淫羊藿女貞子合用糖皮質激素抗哮喘大鼠的實驗研究

劉仁慧，許利平，楊婧

本實驗在前期研究已建立的哮喘大鼠模型的基礎上[1]，給予地塞米松干預治療2周，并同時配合服用淫羊藿女貞子煎劑，觀察淫羊藿女貞子合激素干預治療對哮喘大鼠氣道炎癥、糖皮質激素作用途徑等的影響作用，為后期應用平補陰陽中藥協同激素干預哮喘模型提供實驗與理論依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠，體重（120±10）g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供(合格證號：SCXK-（軍）2007-004)。

1.2 試劑與藥品

卵清白蛋白（OVA）、氫氧化鋁凝膠、地塞米松（Dex），美國 Sigma公司；地塞米松磷酸鈉注射液，天津藥業焦作有限公司；促腎上腺皮質激素（ACTH）、皮質醇（COR）放免試劑盒，北京北方生物技術研究所；促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）放免試劑盒，北京華英生物技術研究所；大鼠IL-4、IL-5、INF-γ酶免試劑盒，上海朗頓生物科技有限公司；糖皮質激素受體（GCR）單克隆一抗，美國Abcam；Fitc-GCR二抗，北京成文化學免疫研究室；Fitc- Dex，美國Molecular Probes。淫羊藿、女貞子藥材均購于北京同仁堂藥店。

1.3 實驗器材

402A超聲霧化器，江蘇魚躍醫療設備股份有限公司；霧化箱，以有機玻璃為材料自制，規格：40×30×20cm3；XH6080放免儀，西安核儀廠；酶標儀，Denley Dragon Wellscan MK2型USA；流式細胞儀FACS Calibur，美國BD公司。

2 方法

2.1 分組方法

按隨機數字表法分為5組，即正常對照組（N組）、哮喘模型組（A組）、激素干預組（GC組），淫羊藿女貞子組（YN組），淫羊藿女貞子合激素干預組（YN+GC組），每組8只。

2.2 造模、給藥方法

實驗d1-35，除正常對照組外，其余動物全部造模[1]。實驗d36-48，激素干預組、淫羊藿女貞子合激素干預組 ip 地塞米松注射液0. 5 mgkg-1，qd，連用2周；淫羊藿女貞子組、淫羊藿女貞子合激素干預組ig淫羊藿女貞子水溶液（9. 5 gkg-1），qd，連用2周；同時，除正常對照組外，其余動物每周2 次給予1%OVA 霧化吸入直至實驗結束。

2.3 取材處理

大鼠腹腔麻醉, 腹主動脈取血, 分離取血清及血漿。血清用于COR檢測；血漿用于ACTH 檢測。右肺行支氣管肺泡灌洗術，回收支氣管肺泡灌洗液（BALF），分離BALF上清液，用于IL-4、IL-5、INF-γ檢測，BALF沉淀加4%多聚甲醛固定，用于GCR檢測。斷頭后, 迅速摘取下丘腦，用于CRH 檢測。

2.4 觀測指標與檢測方法

2.4.1 IL-4、IL-5、INF-γ 按照試劑盒說明書，采用ELISA法檢測。

2.4.2 COR、ACTH、CRH 按照試劑盒說明書，采用RIA法檢測。

2.4.3 GCR含量的檢測 采用流式細胞法。GCR蛋白表達檢測：BALF沉淀0.5 mL，PBS 洗2次；加入破膜劑（0.1% Triton-X 100 -10%山羊血清-PBS）重懸細胞，冰上靜置后離心，PBS 洗滌1次；吸棄上清，加入GCR一抗，同型對照管中加入等量IgGl，冰上避光靜置；PBS 洗滌1次，加入Fitc-GCR二抗，冰上避光靜置；PBS洗滌2次，棄上清；2%多聚甲醛重懸固定，4℃避光保存，上機檢測。GCR結合力檢測：BALF沉淀0.5 mL，PBS 洗滌2次；加入破膜劑重懸細胞，冰上靜置后離心，PBS洗滌2次；100 μLPBS重懸，37℃孵育10 min，加入2×10-5M Fitc-Dex，對照管提前10 min加入500倍于Fitc-Dex的Dex做為同型對照， 37℃，室溫避光靜置60 min，PBS洗滌2次，棄上清；2%多聚甲醛重懸固定，4℃避光保存，上機檢測。GCR的表達量用單細胞表達量的平均熒光強度表示。

2.5 統計學方法

數據采用均數±標準差（xˉ±S）表示，組間比較采用方差齊性檢驗及單因素方差分析，根據方差齊性檢驗結果選擇LSD（方差齊）或Tamhane’s T2（方差不齊），采用SPSS 11.0 for Windows軟件包完成。

3 結果

3.1 各組大鼠BALF INF-γ、IL-4、IL-5的比較（見表1）

表1 各組大鼠INF-γ、IL-4、IL-5的比較（xˉ±S，n=10）

結果顯示：與正常對照組比較，哮喘模型組BALF 中INF-γ含量明顯降低（P0.01），IL-4、IL-5含量明顯升高（P0.01、0.05）。與哮喘模型組比較，各給藥組均能顯著抑制升高的IL-4含量（均P0.01），此外淫羊藿女貞子合激素干預組可顯著升高INF-γ含量及INF-γ IL-4比值（P0.05、0.01），激素干預組可顯著升高INF-γ IL-4比值（P0.01）。

3.2 各組大鼠血清COR、血漿ACTH、下丘腦CRH含量的比較（表2）

表2 各組大鼠COR、ACTH、CRH的比較（xˉ±S，n=10）

結果顯示：COR、ACTH、CRH含量哮喘模型組較正常對照組均無差異，而激素干預組均較正常對照組、哮喘模型組顯著改變（P0.05或0.01）；淫羊藿女貞子合激素干預組與激素干預組比較，ACTH、CRH含量有顯著差異（均P0.01），COR含量有升高的趨勢。

3.3 各組大鼠BALF 中GCR蛋白表達和結合力的比較（表3）

表3 各組大鼠GCR蛋白的比較（xˉ±S，n=6）

結果顯示：與正常對照組比較，哮喘模型組GCR蛋白結合力明顯降低（P0.01）。激素干預組GCR蛋白表達量及GCR蛋白結合力較正常對照組與哮喘模型組均降低明顯（P0.05或0.01）。與激素干預組比較，淫羊藿女貞子合激素干預組GCR蛋白表達量及GCR蛋白結合力均明顯升高（P0.05或0.01）。

4 討論

Th1/Th2細胞及其細胞因子的失衡是參與哮喘氣道炎癥的重要發病機制之一，研究表明[2～3]哮喘大鼠的Th1類細胞因子IFN-γ等表達明顯下降，Th2類細胞因子IL-4、IL-5等表達明顯上升，與本課題的研究結果吻合。GC抑制氣道炎癥的機制與其調節Th1/Th2平衡有關，對Th1、Th2細胞均有抑制作用，而對Th2細胞的抑制作用更加顯著[4～5]。本課題研究表明：激素干預組能顯著抑制哮喘大鼠 IL-4水平，對IFN-γ的影響作用不顯著，提示GC調節Th1/Th2平衡的作用主要體現在抑制Th2細胞功能亢進。配伍中藥淫羊藿女貞子后，結果提示淫羊藿女貞子合激素干預組除具有同激素相似的抑制Th2功能亢進的作用，且能顯著上調IFN-γ水平，升高IFN-γ/ IL-4比值，從而雙向調節Th1/Th2平衡的作用，達到協同增效的作用。

哮喘存在低皮質醇等HPA 軸不同程度的抑制現象，雖補充外源性GC是治療哮喘的首選方法，但大劑量地使用GC類藥物或長期小劑量地使用此類藥物就會引起腎上腺皮質功能的抑制[6～7]，從而導致內源性COR含量顯著降低，下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能紊亂，GCR數量或功能亦出現異常。本實驗結果顯示：激素干預組血清COR 、BALF GCR蛋白表達及結合力均顯著降低，而ACTH及CRH含量反饋性增高，提示哮喘大鼠給予激素治療后，內源性GC作用途徑受到顯著抑制。 GC合用淫羊藿女貞子配伍后，顯著下調ACTH、CRH含量，上調GCR含量及蛋白表達，從而對內源性GC作用途徑起到保護作用，改善GC 類藥物對內源性GC 的抑制。

[1] 劉仁慧,鄭君芳,袁穎,等.淫羊藿女貞子配伍調節哮喘大鼠NO/ET及HPA軸作用的研究[J].中國中藥雜志,2010,35(12):1590.

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[5] 劉紅兵,陶曉南,馮罡,等.糖皮質激素對哮喘大鼠T-bet及γ-干擾素表達的影響[J].華中科技大學學報,2008,37(4):465.

[6] 魏而清,唐法娣,陳麗萍,等.腎上腺皮質功能對豚鼠實驗性哮喘的調控作用[J].中國病理生理雜志,1996,12(3):244.

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