HPLC法對細辛含藥血清中AAⅠ的含量測定

黃必勝，周禎祥，黃保希

1 儀器與試劑

1.1 儀器

戴安高效液相色譜儀：P680型輸液泵、在線脫水機、手動進樣器、TCC-100柱溫箱、PDA-100二極管陣列檢測器、chromeleon色譜工作站，戴安公司。

1.2 試劑

馬兜鈴酸A(AAⅠ)：中國藥品生物制品檢定所（批號：110746-200305)；甲醇（色譜純）：上海振興化工一廠；冰乙酸（分析純）：天津市科密歐化學試劑開發中心；重蒸餾水、細辛含藥血清和空白含藥血清：由課題組提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：D i a m o n T M O D S-C 1 8(2 5 0 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水-醋酸（72∶27∶1）；柱溫：室溫；檢測波長：390 nm；流速：1 mLmin-1。

2.2 AAⅠ對照品溶液、供試品溶液和空白血清組溶液的制備

精密稱取適量AAⅠ對照品8 mg，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，制得AAⅠ對照品溶液，避光保存備用。精密量取細辛含藥血清和空白血清各15 mg分別置于25 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，制得供試品溶液和空白對照組溶液，避光保存備用。

2.3 系統適用性實驗

取AAⅠ對照品溶液、供試品溶液及空白對照品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀按以上色譜條件測定，記錄色譜圖，結果見圖1～3。由圖1～3可知，AAⅠ的保留時間為16.833 min。

2.4 標準曲線的制備與線性考察

精密吸取AAⅠ對照品儲備溶液0.06 mL，0.12 mL，0.3 mL，0.6 mL，3 mL，6 mL，分別置于10 mL的容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，進樣為20 μL，記錄峰面積，以AAⅠ對照品溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線（見表1，圖4）。結果表明，AAⅠ峰面積在0.2～0.6 mgL-1濃度范圍內呈良好的線性關系，最低檢測限為0.2 μgmL-1。回歸方程為Y=7262.8X+2.4（r=0.9988，n=5）。

表1 AAⅠ對照品標準曲線測定峰面積

圖4 AAⅠ對照品標準曲線

2.5 精密度考察

精密吸取AAⅠ對照品溶液20 μL，進樣5次，得峰面積值的RSD=2.68%（n=5），結果表明儀器與色譜條件具有良好的精密度。結果見表2。

表2 精密度考察（n=5）

2.6 穩定性考察

取供試品溶液，在配制后0 h，4 h，8 h，12 h，16 h和24 h于同一色譜條件下分別進樣20 μL，所得峰面積值的RSD=2.38%（n=6），表明供試品溶液在24 h內基本穩定。結果見表3。

表3 穩定性考察（n=6）

2.7 加樣回收率考察

精密吸取供試品溶液10 mL平行6份，分成3組，每組2份，分別加入AAⅠ對照品溶液0.5 mL，1 mL及2 mL，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別進樣20 μL，記錄色譜圖。得出平均加樣回收率為100.02%，RSD=2.74%（n=6)。結果見表4。

表4 加樣回收率考察（n=6）

2.8 細辛含藥血清中AAⅠ含量測定

分別取供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀分析，記錄峰面積，以外標法計算AAⅠ的含量，結果供試品中AAⅠ的含量低于最低檢測限，故忽略不計其具體含量（表10）。

表5 細辛含藥血清中AAⅠ含量測定(n=6)

3 討論與體會

馬兜鈴酸（aristolochic acid，AA）可引起腎臟損害的臨床報道和毒理研究已經引起全世界的廣泛關注和高度重視。2000年5月，美國藥品與食品管理局（FDA）公布了含有AA的植物品種名單[1]，其中涉及17種中藥材，馬兜鈴科細辛屬細辛被列在名單之中。

AA可引起慢性腎臟損害，國外學者稱之為“中草藥腎病”（Chinese herbs nephropathy，CHN）[2]。國內學者認為[3～6]，AA是引起CHN的主要毒性物質，而含AA的僅限于馬兜鈴屬的少數藥物，并非所有中藥都會引起腎損害。因此，國內學者提出“馬兜鈴酸腎病”（aristolochic acid nephropathy，AAN）這一概念，得到了國內外學者的普遍認同。

AA類物質是3，4-次甲二氧基-10硝基-1菲類衍生物，是馬兜鈴科馬兜鈴屬植物所含的共有成分。AA主含AAⅠ，馬兜鈴酸B（AAⅡ）和馬兜鈴內酞胺Ⅰ（ALⅠ）等，是目前公認的毒性成分，其中AAⅠ含量最高[8]。據報道[7]，AAⅠ對腎小管上皮細胞超微結構的影響具有一定的特征性，突出表現為細胞核的損傷。在急性AAN患者的腎活檢組織以及眾多AAN動物模型中發現，腎小管上皮細胞在發生急性損傷、壞死的同時并沒有出現增殖現象。提示AAⅠ及其代謝產物在直接損傷細胞的同時，還抑制了細胞的增殖能力。李氏等[9]研究發現，AAⅠ可致豬腎小管上皮細胞系LLC-PK1細胞DNA損傷，使細胞周期阻滯在G2/M期，認為這可能是AA腎損傷后腎小管上皮細胞再生修復能力差的機制之一。以上研究均表明，AAⅠ是AA造成腎損傷的主要毒性物質。

相關文獻報道[10～11]，AAⅠ在細辛藥材特別是在其根及根莖中含量很低，甚至痕量，以至于薄層色譜對其檢測不到，而必須用靈敏度高的方法才能檢測到。本實驗用HPLC法檢測細辛含藥血清中AAⅠ，結果低于最低檢測限，說明細辛含藥血清中不含AAⅠ。因此，本研究認為，細辛雖屬馬兜鈴科植物，但在常規使用下，是有效、安全的，不會引起腎毒或腎損傷。

[1] 鮑志東,葉晨,黃欣.馬兜鈴屬植物的腎毒性[J].國外醫學中醫中藥分冊,2001,23(5):259.

[2] 孫偉.對中草藥腎毒性的理性探討[J].江蘇中醫,2001,22(10):1.

[3] 諶貽璞,陳文.馬兜鈴酸腎病存在四種臨床病理類型[J].中華腎臟病雜志,2000,⑹:406.

[4] 康亞國,宋曉群.對中藥毒性問題的認識[J].陜西中醫學院學報,2001,24(3):51.

[5] 郭功玲,李吉華.對馬兜鈴酸腎病的新認識[J].上海中醫藥雜志,2003,37(1):33.

[6] 陳文,諶貽璞.馬兜鈴酸腎病的診斷與治療[J].醫師進修雜志,2003,26(5):11.

[7] 李恒,劉志紅,陳惠萍,等.馬兜鈴酸I對腎小管上皮細胞超微結構的影響[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2001,10(3):242.

[8] WangYins,PanJing-xian,GaoJian-Jun,et al.The antitumor con hlentsfrom stem of Aristolochiamanshuriensis[J]. Beijing MeclUniv,2000,32(1):18.

[9] 李瑛,劉志紅,郭嘯華,等.馬兜鈴酸I致腎小管上皮細胞DNA損傷的實驗研究[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2004,13(1):7.

[10] 徐玫,李景華.細辛不同部位的馬兜鈴酸A及揮發油含量研究[J].藥物研究,2007,16(10):29.

[11] 黃順旺.北細辛中不含馬兜鈴酸A的薄層色譜法鑒別[J].安徽醫藥,2003,7(4):299.