保腎寧提取液對糖尿病腎病大鼠的防治作用

郭瑩輝

(廊坊市人民醫院內分泌科,河北 廊坊 065000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常見的微血管并發癥,由DN引起的終末期腎病發生率逐年升高[1]。有研究證實,糖尿病腎病時腎組織細胞的過度凋亡與腎臟損害密切相關[2]。保腎寧方以糖尿病腎病陰虛燥熱、傷津耗氣、久病入絡、瘀血阻滯、毒損脈絡、脾腎虧虛的病機特點為基礎,結合現代醫學理論及臨床經驗而擬定,為了進一步驗證其治療作用,筆者觀察了保腎寧提取液對糖尿病腎病大鼠腎臟細胞凋亡的影響,以探討保腎寧提取液對DN大鼠腎臟防治作用的機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SD雄性大鼠50只,體質量180～200 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 藥品及試劑

保腎寧提取液由黃芪、黨參、女貞子、麥冬、葛根 、大黃 、茯苓 、丹皮、川芎、水蛭、鬼箭羽(均購自同仁堂藥房,符合國家藥典標準)組成,水煎醇提后濃縮至含生藥3.15 g?mL-1。貝那普利(商品名:洛丁新,北京諾華有限公司生產,規格:10 mg?片-1),格列喹酮(商品名:糖適平,德國柏林格殷格翰國際公司與北京萬輝藥業集團合作制造,規格:30 mg?片-1)。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司,兔抗Bax和Bcl-2單克隆抗體均為美國Calbiochem公司產品,TUNEL試劑盒由北京中山生物技術有限公司提供。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

將50只SD大鼠適應性喂養1周后,隨機抽取10只SD大鼠暴露右側腎臟后縫合(為假手術組);其余40只行右腎切除術,2周后切口愈合,按50 mg?kg-1腹腔注射 STZ(溶于 0.1 mol?L-1、pH=4.5的枸椽酸鈉緩沖液中),48 h后測血糖≥16.7 mol?L-1,尿糖?～為成模[3]。40只SD大鼠成模35只,按隨機數字表法選取30只分為模型組、西藥組、保腎寧組3組,每組10只。給藥方法:1)模型組:蒸餾水10 mL?kg-1?d-1);2)西藥組:貝那 普利1.7 mg?kg-1?d-1+糖適平5 mg?kg-1?d-1;3)保腎寧組:保腎寧提取液0.1 mL?kg-1?d-1;4)假 手 術 組:蒸 餾 水10 mL?kg-1?d-1,各組均灌胃給藥,時間8周。?

2.2 檢測方法

1)血、尿生化指標測定:用日立7071A全自動生化分析儀測定。2)流式細胞術檢測:操作流程按試劑盒標明的方法進行。蛋白表達定量分析按照O.Morkve等[4]提出的方法,以熒光指數(FI)表示其相對含量。FI=(樣品蛋白表達的平均熒光強度-對照樣品平均熒光強度)/正常對照樣品平均熒光強度,FI＞1.0為陽性表達,FI＜1.0為陰性表達。3)原位末端標記法(T UNEL):按試劑盒標明的方法進行,顯微鏡下觀察,TUNEL陽性反應為細胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒。腎小管細胞凋亡指數=100個腎小管的陽性細胞數/100個腎小管細胞總數;腎小球的凋亡指數用平均單個腎小球切面的陽性細胞數作為比較指標。

2.3 統計學方法

采用Excel軟件及SPSS 10.0統計軟件進行統計分析,實驗數據用均數±標準差()表示,組間比較用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠血清生化指標比較

與模型組相比,西藥組及保腎寧組大鼠血清BUN、Scr、Upro均明顯降低(P ＜0.01),見表1。

表1 各組大鼠血清BUN、Scr、Upro比較

表1 各組大鼠血清BUN、Scr、Upro比較

*P＜0.01與假手術組比較;△P＜0.01與模型組比較。

組別 n BUN ρ/(mmol? L-1)Scr ρ/(μ mol? L-1)Upro(24 h)m/mg假手術組 10 3.96±0.25 69.74±6.78 3.33±1.74模型組 10 15.78±2.17* 192.42±7.56* 16.27±3.75*西藥組 10 9.15±0.78*△ 98.64±11.84*△ 6.45±4.22*△保腎寧組 10 8.02±1.32*△ 96.53±9.65*△ 7.39±2.61*△

3.2 各組大鼠腎組織中Bcl-2、Bax表達比較

保腎寧組及西藥組與模型組比較,可升高Bcl-2、降低Bax的平均光密度值(P＜0.01);保腎寧組在升高Bcl-2、降低Bax方面效果優于西藥組(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腎組織中Bcl-2、Bax表達比較

表2 各組大鼠腎組織中Bcl-2、Bax表達比較

*P＜0.01與模型組比較;△P＜0.05與西藥組比較。

組別 n Bcl-2/FI Bax/FI假手術組 10 1.01±0.12 1.00±0.11模型組 10 0.80±0.14 1.49±0.16西藥組 10 1.05±0.11* 1.08±0.09*保腎寧組 10 1.14±0.15*△ 1.02±0.05*△

3.3 各組大鼠腎組織細胞凋亡情況比較

西藥組及保腎寧組與模型組比較,均能明顯降低腎小球及腎小管細胞凋亡指數(P＜0.01);保腎寧組在降低腎小管細胞凋亡指數方面明顯低于西藥組(P＜0.05),見表3。

表3 各組大鼠腎小球及腎小管細胞凋亡指數比較

表3 各組大鼠腎小球及腎小管細胞凋亡指數比較

*P＜0.01與模型組比較;△P＜0.05與西藥組比較。

組別 n 腎小球細胞凋亡指數 腎小管細胞凋亡指數假手術組 10 0.04±0.12 3.88±0.15模型組 10 0.64±0.13 12.89±0.28西藥組 10 0.40±0.15* 7.62±0.27*保腎寧組 10 0.29±0.09* 4.98±0.09*△

4 討論

細胞凋亡就是細胞死亡,廣義的講,細胞凋亡可包括細胞壞死、溶解和程序性死亡等;狹義地講,是指細胞程序性死亡[5]。DN早期機體通過細胞凋亡清除增生的多余細胞是有益的,但晚期凋亡細胞數往往與腎功能惡化程度成正比[6]。有報道證實糖尿病模型腎組織中細胞凋亡數較非糖尿病腎臟明顯增多,并伴有凋亡相關基因的改變[7]。Bcl-2是一個基因家族,Bax是Bcl-2基因家族中的一個同源蛋白,Bcl-2主要功能是促細胞生存,延長細胞壽命,抑制細胞凋亡,Bax主要作用是促細胞凋亡,Bcl-2與Bax的比例對細胞凋亡有調節作用[6]。

糖尿病腎病屬于中醫學的“消渴”、“水腫”、“虛勞”的范疇,DN病機特點為本虛標實,本虛為氣血陰陽、五臟虧虛,標實為血瘀、痰凝、濕阻、水停、濁毒內生等。筆者根據中醫理論結合長期臨床經驗,以滋陰降火、化瘀瀉濁、健脾益腎為大法,擬定保腎寧方。方中以黃芪、黨參為君藥,健脾益氣,補氣生津,配以女貞子、麥冬,益腎滋陰清熱,加用川芎、水蛭、大黃等藥以祛瘀血、水濕、濁毒之邪。有研究表明,黃芪具有擴管、降壓、利尿作用,能增加腎血流量,反饋性的抑制腎素-血管緊張素系統,增加氧化物的代謝,達到改善腎功能的目的[8];鬼箭羽能夠降低DN大鼠的血糖,同時使DN大鼠的高、低切變率下的全血黏度明顯下降[9];丹參能有效地抑制梗阻性大鼠腎組織中血管緊張素轉換酶的活性,減少血管緊張素Ⅱ含量,進而保護腎臟。

本研究結果發現,保腎寧提取液能夠明顯改善DN大鼠腎功能,降低24 h尿蛋白排泄率,保腎寧提取液對Bax/Bcl-2凋亡相關蛋白的調節及腎臟細胞凋亡的干預,可能是其保護腎臟的作用機制之一。

[1]潘長玉,金文勝.2型糖尿病流行病學[J].中華內分泌代謝雜志,2005,21(5):i0001-i0005.

[2]趙玲,顧江萍,栗德林,等.細胞凋亡與糖尿病腎病的關系及糖腎康作用機制的研究[J].中國中西醫結合腎病雜志,2003,4(8):439-442.

[3]張洪俊.從《內經》看糖尿病遷延不愈的機理與治療[J].中國中醫藥現代遠程教育,2004,2(10):26-27.

[4]Morkve O,Laerun O D.Flow cytometric measurement of p53 protein expression and DNA content in paraffin embedded tissue from bronchial carcinomas[J].Cytometry,1991,12:438-444.

[5]陳慰峰.醫學免疫學[M].北京:人民衛生出版社,2000:158-213.

[6]Sugiyama H,Kashihara N,M akino H,et al.Apoptosis in glomerular sclerosis[J].Kidney Int,1996,49:103-111.

[7]張艷玲,段惠軍,郝文田,等.苯那普利對糖尿病大鼠腎臟細胞凋亡及 Bax和Bcl-2表達的影響[J].中華物理醫學與康復雜志,2001,23(4):237-239.

[8]嚴萍萍,張文芳,李勇,等.黃芪注射液對心力衰竭患者神經內分泌系統的影響[J].中華實用中西醫雜志,2004,17(21):3188-3190.

[9]尚文斌.鬼箭羽對糖尿病小鼠血糖及全血粘度的影響[J].南京中醫藥大學學報:自然科學版,2000,16(3):166-167.