法夫酵母產蝦青素的反復分批及反復分批補料發酵

肖安風，倪輝，李利君，蔡慧農

1 集美大學生物工程學院，廈門 361021

2 廈門市食品生物工程技術研究中心，廈門 361021

法夫酵母產蝦青素的反復分批及反復分批補料發酵

肖安風1,2，倪輝1,2，李利君1,2，蔡慧農1,2

1 集美大學生物工程學院，廈門 361021

2 廈門市食品生物工程技術研究中心，廈門 361021

以生物量和蝦青素產量為指標，考察法夫酵母多批次半連續培養產蝦青素的穩定性。實驗結果顯示，在搖瓶上分別以4 d和5 d為周期反復分批培養法夫酵母，蝦青素產量呈現先增加再下降的趨勢，但第2代至第7代蝦青素產量仍高于第1代，并且4 d為周期的蝦青素平均產量略高于5 d的。在5 L罐法夫酵母進行反復分批補料發酵中，不管是補加30%的葡萄糖還是補加30%的淀粉水解糖，第2個批次發酵的生物量和蝦青素產量均達到第1個批次的水平，表明菌種穩定性較好。

蝦青素，法夫酵母，反復分批發酵，反復分批補料發酵，穩定性

Abstract:A comparative study of batch and repeated batch process was carried out for astaxanthin fermentation of Phaffia rhodozyma to develop a more economical method for astaxanthin industrial production. In shaking flask fermentation, the change of biomass and astaxanthin production was studied to compare the five-day cycle with four-day cycle of repeated batch culture of P. rhodozyma. Astaxanthin production increased at first and then decreased subsequently in seven cycles, yet the yield of astaxanthin in the next six cycles remains higher than that of the first cycle. Comparing the average production of astaxanthin in the seven cycles, four-day cycle performed even better than five-day cycle. Subsequently, a repeated fed-batch process was used in a 5-l bioreactor. The experimental data showed that biomass and astaxanthin production of the second batch could reach the level of the first batch, no matter that the carbon source was glucose or hydrolysis sugar of starch. This result showed that this strain had good stability, and thus repeated batch and fed-batch process could be applied in astaxanthin fermentation for economical purpose.

Keywords:astaxanthin, Phaffia rhodozyma, repeated batch, repeated fed-batch, stability

蝦青素是一種非維生素A原的類胡蘿卜素，具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、提高免疫力等多種生物學功能，在飼料、食品、醫藥、化妝品等行業中具有廣泛的需求，其市場非常廣闊[1]。

作為蝦青素的生產菌，法夫酵母 Phaffia rhodozyma相比雨生紅球藻Haematococcus pluvialis具有許多優勢：可利用多種糖進行快速異養代謝、培養時間短、菌體可綜合利用、發酵過程易于產業化等[2-3]。因此，人們以法夫酵母為研究對象，對菌種選育、發酵技術等方面進行了深入、系統的研究，并獲得了一定的成果。如 Sun等[4]采用 γ射線誘變法夫酵母，Lewis等[5]采用NTG誘變和紫羅蘭酮篩選突變株，法夫酵母的類胡蘿卜素含量均有顯著提高，Chun等[6]利用誘變得到的營養缺陷型菌株作為親本進行原生質體融合，得到類胡蘿卜素含量提高近 4倍的高產菌株。對于法夫酵母發酵，培養基組成及發酵條件是關鍵因素，培養溫度、pH和溶氧條件[7]、C/N比[8]、碳源組成[9]、氮源組成[10]等均對法夫酵母發酵蝦青素的產量或生產成本有影響：Ramirez等[11]采用最陡爬坡法和響應面分析，優化pH、溫度、接種量、碳源濃度和氮源濃度5個因素，蝦青素的最高產量可達8.1 mg/L，較優化前提高了92%；為了降低發酵成本，Haard[12]采用廉價的糖蜜作為發酵底物，蝦青素的產量比用葡萄糖為底物提高 3倍。采用添加前體或促進劑的方式，也可以提高蝦青素的產量：Calo等[13]在培養基中添加 1 g/L的甲羥戊酸，結果蝦青素和總類胡蘿卜素產量提高了300%以上；F1ores-Cotera等[14]發現在培養基中添加檸檬酸可以顯著提高蝦青素的產量和含量。

在微生物培養過程中，采用反復分批發酵工藝，由于只需 1次菌種活化及種子培養，就可以進行多個批次的發酵，大大縮短了發酵時間，可以有效地提高生產率，因此，這種工藝在許多工業發酵過程中都得到了應用[15-17]。目前，人們對法夫酵母產蝦青素的發酵工藝已經做了很多有效的工作，并開發出了適合產業化生產的發酵工藝。不過，由于前期的菌種活化、種子擴大培養需要較長的時間，無形中使發酵周期加長，生產效率也因之下降。本實驗分別在搖瓶和5 L罐上，對比研究分批發酵和反復分批發酵兩種工藝培養法夫酵母蝦青素的差異，考察反復分批發酵工藝應用到法夫酵母蝦青素生產的可行性，以期實現提高生產效率，開發出一種經濟、實用的蝦青素發酵工藝。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養基

法夫酵母Pst-1菌株，由柏林工業大學食品科學系Ulf Stahl教授饋贈，本實驗室保存。

斜面菌種培養基[18]：葡萄糖10 g/L，細菌蛋白胨 3 g/L，麥汁3 g/L，酵母膏3 g/L，瓊脂20 g/L。

種子培養基[19]：葡萄糖 20 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl2·H2O 0.1 g/L，酵母膏3 g/L，pH 6.0。

發酵基礎培養基[19]：葡萄糖35 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl2·H2O 0.1 g/L，酵母膏 3 g/L，pH 6.0。

補料培養基：30%的葡萄糖或淀粉水解糖液。

1.2 種子擴大培養及發酵

1.2.1 菌種制備

將斜面活化的菌種接種至裝有含30 mL發酵基礎培養基的250 mL搖瓶中，22 ℃、180 r/min搖瓶培養4 d，取1 mL一代種子接種于裝液量30 mL的250 mL搖瓶中，22 ℃、180 r/min搖瓶培養2 d[20]。

1.2.2 搖瓶反復分批發酵

將二級種子液以適當的接種量 (10%) 接入裝有含30 mL發酵基礎培養基的250 mL搖瓶中，22 ℃、180 r/min搖床培養一段時間后，以搖瓶發酵液作為種子，按10%的接種量接入另一裝有含30 mL發酵基礎培養基的250 mL搖瓶中進行培養，如此反復進行發酵。

1.2.3 5 L罐反復分批補料發酵

將培養好的搖瓶種子接入裝4 L發酵基礎培養基的發酵罐 (美國NBS公司，BioFlo 110型) 內，22 ℃、pH 4.0、溶氧40%下進行發酵。在發酵過程中，每隔4小時用3,5-二硝基水楊酸法 (DNS法) 檢測發酵液中還原糖濃度，通過調節補料培養基補加速率，控制糖濃度在15~25 g/L 左右。每隔8小時取樣檢測生物量，當生物量在24 h內不再增加時，此時生物量已達到峰值，放罐，留部分發酵液，按10%接種量 (約400 mL) 接入新鮮4 L的培養基，反復進行發酵。

1.3 分析方法

1.3.1 發酵液糖濃度測定

采用 DNS法[21]：取發酵液 3 500 r/min離心5 min，將上清稀釋一定倍數后取1 mL，與3 mL DNS試劑混合，沸水浴反應15 min，冷卻后蒸餾水定容至25 mL，在520 nm處測吸光度。由標準曲線計算即可得到發酵液的糖濃度。

1.3.2 生物量測定

取5 mL菌液3 500 r/min離心5 min后去上清，蒸餾水洗滌菌體，離心去上清，105 ℃下烘至恒重。

1.3.3 蝦青素的提取及測定

取1 mL發酵液樣品3 500 r/min離心5 min，去上清，用蒸餾水洗滌沉淀，菌體加入 2 mL預熱至75 ℃的DMSO，立即劇烈振蕩，50 ℃破壁5 min，再加入5 mL的無水乙醇，振蕩搖勻，3 500 r/min離心5 min，將上清用無水乙醇定容至10 mL，用紫外分光光度計在474 nm下測定吸光值[22]。

1.3.4 二次參數計算

根據得到的生物量濃度、蝦青素濃度及發酵液的糖濃度，計算蝦青素單產、細胞得率和蝦青素得率，計算公式如下：

蝦青素單產=蝦青素濃度/生物量濃度 (mg蝦青素/g干細胞)；

細胞得率=生物量濃度/消耗的糖濃度 (g干細胞/g 糖)；

蝦青素得率=蝦青素濃度/消耗的糖濃度 (mg蝦青素/g糖)。

2 結果與分析

2.1 搖瓶反復分批發酵實驗結果

本菌種在搖瓶培養的第 4天進入穩定期，此時發酵液中的生物量和蝦青素濃度接近或達到最大值，此后 2 d內生物量和蝦青素含量基本不變，因此，在搖瓶上，選擇4 d和5 d周期進行反復分批發酵，分別在每個周期結束時取樣檢測生物量、蝦青素濃度和糖濃度，并計算每個周期的蝦青素單產、細胞得率和蝦青素得率。

圖1是以4 d和5 d為周期的反復分批發酵，其傳代次數和法夫酵母生物量及蝦青素產量變化的關系圖。以4 d為周期進行反復分批發酵，前3個批次的生物量比較接近，在4 g/L左右，4~7代生物量有所增加，在6 g/L的范圍；而以5 d為周期進行反復分批發酵，前 4個批次呈現增加的趨勢，第 4~7個批次，生物量也基本穩定在6 g/L左右。從蝦青素產量變化來看，4 d為周期反復分批發酵的蝦青素產量，在第2個批次達到最高值3.59 mg/L，從第 2個批次開始呈遞減的趨勢，至第 7批次降至1.99 mg/L，與第1個批次1.95 mg/L基本相等；5 d為周期發酵的蝦青素產量，前2個批次蝦青素含量約為2 mg/L，第3批次略有下降，為1.77 mg/L，第4批次增至3.17 mg/L，然后呈遞減趨勢，至第7代減至2.13 mg/L。

從單產來看，4 d為1周期的蝦青素單產，其數值先呈增加趨勢，第2和第3批次分別達到0.96 mg蝦青素/g干細胞和0.90 mg蝦青素/g干細胞，隨后單產開始遞減，其中第4、第5批次單產略高于第1批次，而第6、第7批次略低于第1批次；5 d為一周期的單產最大在第 1批次，蝦青素單產達到1.25 mg蝦青素/g干細胞，第2~6批次穩定在0.5 mg蝦青素/g干細胞左右。比較可知，5 d為周期的單產總體上高于4 d周期的單產。

圖1 不同周期搖瓶反復分批發酵試驗結果Fig. 1 Change of cell growth and astaxanthin formation in repeated batch culture of P. rhodozyma in shaking flask fermentation.

比較兩種周期反復分批發酵的蝦青素平均產量，以4 d為周期進行反復分批發酵，蝦青素平均產量為2.70 mg/L，5 d周期的蝦青素平均產量為2.35 mg/L，前者略高于后者，此外，4 d周期所需發酵時間更短，因此，在搖瓶上進行 4 d周期的反復分批發酵，要優于5 d周期的反復分批發酵。

由此可見，在一定批次內進行搖瓶反復分批發酵，對法夫酵母細胞的生長和蝦青素生產有利。這說明本菌株生產蝦青素的性能比較穩定，不會出現因傳代次數多而導致菌株退化、產物產量下降的情況。

2.2 罐上反復分批補料發酵實驗結果

2.2.1 補葡萄糖對法夫酵母產蝦青素的影響

在5 L罐中，以葡萄糖作為碳源，進行兩個批次的反復分批補料發酵，取樣檢測發酵過程生物量、蝦青素濃度和葡萄糖濃度，根據生物量、蝦青素濃度和葡萄糖消耗量變化，進行單產、細胞得率和蝦青素得率的計算，所得結果如圖2所示。

從圖2可以得出，在反復分批補料過程中，兩個批次的生物量變化曲線基本一致，在發酵過程呈現快速增長的趨勢，在批次發酵的后期，生物量均達到最大值，分別為47.0 g/L (第1批次) 和49.5 g/L(第2批次)。在每個批次發酵的前26 h，葡萄糖消耗量近似為 0，隨著發酵時間的進行，每個批次的葡萄糖消耗量均不斷增加，但第2個批次的糖耗要稍少于第 1個批次的糖耗。每個批次蝦青素濃度隨時間呈遞增的現象，第 1個批次蝦青素濃度最大值為18.96 mg/L，而第 2個批次蝦青素濃度最大值為23.14 mg/L，在獲得相等的生物量的情況下，第 2個批次發酵所獲得的蝦青素要高于第1個批次。

圖 2 以葡萄糖作為碳源進行罐上反復分批補料發酵試驗結果Fig. 2 Profiles of cell growth, astaxanthin formation and quandratic parameters in repeated fed-batch with 30% glucose in 5-l bioreactor. ▲: dry cell weight; ●: astaxanthin concentration; +: consumed glucose; ?: yield of astaxanthin on biomass; ○: yield of astaxanthin on consumed glucose; ×: yield of biomass on consumed glucose.

對二次參數的變化情況進行分析，可以看出，第1批次蝦青素單產在18 h時為0.74 mg蝦青素/g干細胞，隨后穩定0.3~0.60 mg蝦青素/g干細胞之間，第 2個批次蝦青素單產沒有出現突然增大的情況，前50 h逐漸增大，最后穩定在0.4~0.6 mg蝦青素/g干細胞之間，第 2批次發酵中后期蝦青素單產要略高于第1批次。

兩個批次細胞得率變化有所不同，第 1個批次細胞得率變化比較穩定，前期在0.25 g干細胞/g糖左右變化，然后細胞得率呈緩慢下降趨勢，最終降至0.12 g干細胞/g糖。第2個批次細胞得率由0.23 g干細胞/g糖突然升至最大值1.52 g干細胞/g糖，然后在40 h內迅速降至0.21 g干細胞/g糖，后期細胞得率下降緩慢，最終為0.14 g干細胞/g糖。

比較兩個批次的蝦青素得率變化，蝦青素得率前期均迅速增加，達到最大值，然后出現連續下降。雖然第1個批次蝦青素得率最大值 (0.23 mg蝦青素/g糖) 大于第2個批次 (0.18 mg蝦青素/g糖)，但第1個批次蝦青素得率下降速率比第2個批次快，因此在發酵中后期，第2個批次的蝦青素得率明顯高于第1個批次。

對圖 2的發酵參數變化進行總體分析，可以發現，兩個批次的生物量、蝦青素含量、蝦青素單產、細胞得率、蝦青素得率均有類似的變化趨勢，而且第 2個批次所獲得的生物量和蝦青素并未降低，這說明以葡萄糖作為碳源，進行法夫酵母產蝦青素的反復分批補料發酵是可行的。

2.2.2 補水解糖對法夫酵母產蝦青素的影響

由于法夫酵母發酵過程需要消耗大量的葡萄糖，為了降低成本，可以用主要成分為葡萄糖的淀粉水解糖代替葡萄糖進行發酵。在本試驗中，用淀粉水解糖代替葡萄糖作為碳源，在5 L罐中進行反復分批補料發酵，取樣檢測生物量、蝦青素濃度和殘糖，并計算二次參數變化，結果如圖3所示。

從圖 3可以得出，以淀粉水解糖作為碳源進行反復分批補料發酵，兩個批次的生物量變化曲線基本一致，在發酵過程呈現快速增長的趨勢，在批次發酵的后期，生物量均達到最大值，分別為27.2 g/L(第1批次) 和29.5 g/L (第2批次)。隨著發酵的進行，不斷消耗淀粉水解糖，其中第 2個批次達到較大生物量所需要的水解糖量略少于第1個批次。第1個批次蝦青素濃度呈現持續增長的情況，甚至在發酵后期，生物量不再增加時，蝦青素濃度還有較大增長，最終達到17.34 mg/L；第2個批次蝦青素濃度變化與細胞生長呈正相關的關系，當細胞生長停滯時，蝦青素濃度穩定在13 mg/L的范圍，后期細胞出現衰亡，蝦青素濃度也下降。可以發現，第2個批次蝦青素含量的增長速率明顯高于第 1個批次，除去最終階段的兩個點，蝦青素含量第2個批次高于第1個批次。

圖 3 以淀粉水解糖作為碳源進行罐上反復分批補料發酵試驗結果Fig. 3 Profiles of cell growth, astaxanthin formation and quandratic parameters in repeated fed-batch with 30%hydrolysis sugar of starch in 5-l bioreactor. ▲: dry cell weight;●: astaxanthin concentration; +: consumed sugar; ?: yield of astaxanthin on biomass; ○: yield of astaxanthin on consumed sugar; ×: yield of biomass on consumed sugar.

對二次參數的變化情況進行分析，第 1批次在8 h時為1.57 mg蝦青素/g干細胞，隨后降至0.3 mg蝦青素/g干細胞左右 (16~56 h)，64 h后穩定在0.6 mg蝦青素/g干細胞之間，第2批次自136 h開始，蝦青素單產沒有出現突然增大的情況，而是出現逐步上升的趨勢，至244 h達到最大值0.57 mg蝦青素/g干細胞。比較兩個批次的蝦青素單產，在發酵中后期兩個批次差別不大。

兩個批次細胞得率變化均出現先增加再下降的情況，其中第 1個批次細胞得率變化比較穩定，細胞得率在16 h達到最大值0.33 g干細胞/g糖，然后呈緩慢下降趨勢，最終降至0.12 g干細胞/g糖。從136 h至172 h，第2個批次的細胞得率出現一較快增長，172 h達到最大值1.30 g干細胞/g糖，然后緩慢下降，發酵結束時降至0.06 g干細胞/g糖。

第 1個批次蝦青素得率變化出現先上升再下降的趨勢，整個變化過程比較平穩，64 h時達到最大值0.11 mg 蝦青素/g糖。第2個批次，蝦青素得率先快速增加，至172 h達到0.51 mg蝦青素/g糖，然后迅速降至0.1 mg蝦青素/g糖左右，至發酵結束時蝦青素得率最低，為0.04 mg蝦青素/g糖。

對圖3的發酵參數變化進行總體分析，第1和第 2個批次的生物量、蝦青素含量、蝦青素單產、細胞得率、蝦青素得率變化趨勢基本一致。相對于第1個批次，第2個批次所獲得的生物量和蝦青素并未降低，說明以淀粉水解糖作為碳源，進行連續兩個批次的法夫酵母產蝦青素的反復分批補料發酵，不會出現因菌種退化而導致產量下降的情況。

3 討論

工業發酵過程廣泛采用分批和分批補料發酵工藝，但是，每個發酵批次均要花費相當長的時間制備種子，同時每次均要對所涉及的發酵設備進行滅菌，過程繁瑣且費時[23]。采用反復分批發酵工藝，只需要進行一次菌種活化及種子培養，就可以進行多個批次的發酵，因而大大地縮短了發酵時間，可以有效地提高生產率，在工業發酵過程中有很好的應用前景。

一般來說，處于對數生長期的微生物活力最高，此時最適宜作為種子接入進行發酵，因此，當部分發酵液取出作為種子接入發酵罐后，原來的發酵罐會繼續補料發酵一段時間，至生物量或產量達到最大后放罐，這樣，實現多批次的反復分批補料發酵就需要兩個以上的發酵罐[16,24]。在本實驗中，選取進入穩定期的酵母進行接種，此時的生物量和蝦青素產量已達到最大值，因此在每個批次發酵結束后，直接放罐，只留下部分發酵液作為下一個批次的種子在罐中，因此只需要1個發酵罐 (或搖瓶) 就可以實現連續多個批次的反復分批發酵，而每個批次是一個完整的分批發酵流程。這種發酵方式節省了發酵設備，在工業發酵過程具有實際的應用價值。

反復分批發酵過程中會出現批次產量下降的情況[25-26]，其主要原因是菌種退化。在本實驗中，與分批發酵 (第1個批次) 的結果相比，生物量和蝦青素產量并未出現下降，這說明菌種穩定性較好。反復分批發酵過程中出現產量下降的另一個可能原因是發酵液中乙醇、乙酸或其他代謝副產物的積累，導致細胞生長和產物合成受到抑制[27]。但在本實驗的搖瓶反復分批發酵過程中，反而出現后 6個批次的蝦青素產量普遍高于第 1個批次的情況。比較搖瓶培養和5 L罐的發酵條件，可知搖瓶培養容易出現氧供應不足的情況，因而發酵過程中會產生較多的乙醇、乙酸等酵解產物。文獻報道，在法夫酵母發酵過程中添加乙醇、乳酸、檸檬酸、乙酸等糖代謝產物，對法夫酵母產蝦青素有一定的促進作用[8,14,21]。因此，在搖瓶培養中，部分葡萄糖代謝生產乙醇、乙酸等副產物，當葡萄糖消耗完后，法夫酵母重新利用這些糖代謝產物，使蝦青素的合成受到促進，蝦青素的產量提高。而在5 L罐發酵中，溶氧一直維持在40%左右，較少產生乙醇、乙酸等糖代謝副產物，而且發酵過程通過補料控制糖濃度在15~25 g/L 左右，糖代謝副產物的利用受到抑制，因此，第2個批次的蝦青素產量并未有明顯的提高。

4 結論

法夫酵母生產蝦青素搖瓶反復分批發酵與 5 L罐反復分批補料發酵的研究結果表明：搖瓶發酵，4 d周期蝦青素產量和5 d周期的變化趨勢相似，4 d周期的蝦青素產量略高于 5 d的。以葡萄糖為碳源的5 L 罐發酵，相對第1批次，第2批次的生物量和蝦青素變化趨勢類似，最高生物量和蝦青素產量略有增加。以淀粉水解糖作為碳源的5 L罐發酵，以淀粉水解糖作為碳源，第1和第2批次的生物量、蝦青素含量、蝦青素單產、細胞得率、蝦青素得率變化趨勢相似，菌種沒有退化。

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Repeated batch and fed-batch process for astaxanthin production by Phaffia rhodozyma

Anfeng Xiao1,2, Hui Ni1,2, Lijun Li1,2, and Huinong Cai1,2
1 College of Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, China
2 Research Center of Food Biotechnology, Xiamen 361021, China

Received: June 17, 2010; Accepted: August 11, 2010

Supported by: National Basic Research Programs of China (973 Program) (No. 2005CB523202), Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period (No. 2006BAD06A04).

Corresponding author: Xiaomei Wang. Tel: +86-451-85935004; E-mail: xmw@hvri.ac.cn

國家重點基礎研究發展計劃 (973計劃) (No. 2005CB523202),“十一五”國家科技支撐計劃 (No. 2006BAD06A04) 資助。