高通量脂肪酶穩(wěn)定性測定法-ANS法的建立

馮蔚宗，林俊涵，菜少麗，鄒有土，陳國仁，黃平，林雅靜，王冰冰，林琳

福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350108

高通量脂肪酶穩(wěn)定性測定法-ANS法的建立

馮蔚宗，林俊涵，菜少麗，鄒有土，陳國仁，黃平，林雅靜，王冰冰，林琳

福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350108

根據(jù)蛋白質(zhì)變性后結(jié)構(gòu)變化的特點和熒光探針8-苯胺基-1-萘磺酸 (8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS)的特性，建立了一種快捷而準確的脂肪酶熱穩(wěn)定性 (Tm) 測定的新方法——ANS脂肪酶穩(wěn)定性測定法，即將脂肪酶在25 ℃~65 ℃的不同溫度下保溫30 min后，加入到ANS反應(yīng)體系 (0.2 mg/mL酶蛋白，0.05 mmol/L ANS，20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)，100~500 mmol/L NaCl) 中。在激發(fā)波長378 nm，發(fā)射波長465 nm下測定熒光值。通過GraphPad Prism軟件分析得出脂肪酶的 Tm。利用該方法測定了野生型擴展青霉脂肪酶及其突變體的Tm值，結(jié)果與傳統(tǒng)的 NaOH滴定和平板透明圈法的測定結(jié)果相似。同時，利用該方法可在96孔板上快速完成數(shù)十個樣品的Tm測定，從而成為一種快速、可靠、可用于高通量的酶穩(wěn)定性的測定方法。

脂肪酶，熱穩(wěn)定性，8-苯胺基-1-萘磺酸 (ANS)

Abstract:We have developed a rapid and high throughput lipase-ANS (8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid) assay to evaluate the thermo-stability of lipases based on the ANS fluorescence signal’s increasing and shifting when this small fluorescence probes binds to lipase. The testing lipase samples were incubated at a temperature range of 25 °C to 65 °C for 30 min before mixed with ANS solution (0.20 mg/mL lipase and 0.05 mmol/L ANS in the buffer of 20 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L NaCl, pH 7.2) in a cuvette or microplate. Fluorescence signals of the samples were measured at EX 378 nm, EM 465 nm with a fluorescence photometer or a plate reader, and Tmwas calculated with the software of GraphPad Prism5.0. The Tmvalues of several mutants of Penicillium expansum lipase (PEL) were measured with this ANS assay and conventional method simultaneously and the results show that Tmvalues are comparative and consistent between these methods, suggesting that the lipase-ANS assay is a reliable,rapid and high throughput method for lipase thermo-stability measurement.

Keywords:lipase, thermostability, 8-anilino-1-naphthalenesul-fonic acid (ANS)

脂肪酶的熱穩(wěn)定性一直是困擾脂肪酶的生產(chǎn)和應(yīng)用的一個大問題，熱穩(wěn)定性好意味著使用壽命長、作用效果好、易生產(chǎn)、保存和運輸。因此，研究其熱穩(wěn)定性具有十分重要的科學(xué)及實踐意義。目前，脂肪酶的熱穩(wěn)定性通常采用脂肪酶溫浴后測定其酶活的變化來確定，耗時繁瑣，測定幾個樣品需要2~3 d。特別是目前人們常用基因隨機突變、DNA Shuffling等技術(shù)來提高酶的熱穩(wěn)定性，在含有成千上萬突變體的突變庫中篩選出熱穩(wěn)定性高的突變體。尋找和建立一種快捷、準確的脂肪酶熱穩(wěn)定性測定方法是目前脂肪酶研究迫切需要的。

天然水溶性蛋白的內(nèi)部大多數(shù)為疏水氨基酸，分子表面則常為極性親水氨基酸，蛋白質(zhì)受熱吸收能量后開始解折疊，內(nèi)部疏水基團逐漸暴露，在某種程度上，疏水基團的暴露程度隨著溫度的升高而增大。若能找到某種方法測出這種變化，并排除外界因素的影響，則能快速揭示蛋白的熱穩(wěn)定性。

ANS (8-苯胺基-1-萘磺酸，8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid) 是一種性質(zhì)特殊且穩(wěn)定的熒光探針，它可與蛋白質(zhì)的疏水基團緊密結(jié)合，在378 nm激發(fā)光的激發(fā)下能強烈地發(fā)出熒光并導(dǎo)致產(chǎn)生發(fā)射波長的移動。理論上，未變性脂肪酶的疏水基團包裹在分子內(nèi)部，添加ANS后僅發(fā)出微弱的熒光；熱變性的脂肪酶疏水基團暴露，添加ANS后將發(fā)出強烈的熒光，熒光強度與脂肪酶的熱變性程度呈正相關(guān)[1-2]。據(jù)此，有研究將脂肪酶在一系列溫度條件下溫浴后，加入一定量的 ANS，利用熒光檢測儀器檢測其熒光強度，作出熒光強度值與溫度的函數(shù)關(guān)系圖[2-3]，分析得到脂肪酶的 Tm值，從而了解酶的熱穩(wěn)定性。本文報道了這種快捷和有效的脂肪酶熱穩(wěn)定性測定方法——ANS脂肪酶熱穩(wěn)定性測定法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂肪酶酶液為本實驗室發(fā)酵的基因工程脂肪酶，ANS和Braford assay試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，DE52陰離子交換樹脂為GE公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

恒溫水浴鍋 (上海一恒DK-8D型)，熒光分光光度計 (HITACHI F-4600)，多功能酶標儀 (BioTek Synergy HT)，蛋白質(zhì)純化設(shè)備 (上海琪特，HD-21-88型)，超濾濃縮裝置 (AMICON，Model 8050) 等。

1.3 方法

1.3.1 酶液的處理

含色素粗酶液：基因工程擴展青霉脂肪酶產(chǎn)生菌甲醇誘導(dǎo)搖瓶發(fā)酵96 h，10 000 r/min離心20 min獲得發(fā)酵上清；發(fā)酵上清用60%硫酸銨沉淀8 h，10 000 r/min離心20 min，沉淀用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 7.2) 溶解并透析除鹽，每4小時換一次透析緩沖液，共3次。透析后的酶液有較深的色素。

脫色素粗酶液: 含色素粗酶液通過一個除色素短柱，獲得除去色素的酶液。

純酶液：將含色素粗酶液過DE52離子交換柱，以 20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.2)，250 mmol/L NaCl洗脫液洗脫，獲得純化的酶液。

1.3.2 熒光光譜分析

熒光分光光度計測定：用20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl緩沖液 (pH 7.2) 配制含0.2 mg/mL脂肪酶、0.04 mmol/L ANS的測試液600 μL。設(shè)置熒光分光光度計的參數(shù)如下：EX WL 378 nm，EX slit 5 nm，EM slit 5 nm，PMT Voltage 750 V，反應(yīng)時間0.5 s，掃描范圍：400~700 nm，掃描模式：Emission。進行發(fā)射光譜的掃描，以確定合適的發(fā)射波長。

多功能酶標儀測定：用20 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl緩沖液 (pH 7.2) 配制含0.2 mg/mL脂肪酶、0.05 mmol/L ANS的測試液，置于96孔板中，設(shè)置多功能酶標儀的參數(shù)為：EX：360 nm/20 nm，EM：460 nm/20 nm，sensitivity:55，讀取熒光強度值。

1.3.3 ANS脂肪酶Tm測定

將酶液在 25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃下保溫 30 min后，與40 μmol/L ANS溶液混合，緩沖體系采用20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl (pH 7.2) 以激發(fā)波長378 nm，發(fā)射波長 465 nm (酶標儀下為 EX：360 nm/20 nm，EM：460 nm/20 nm，sensitivity:55)，讀取熒光值。GraphPad Prism軟件分析得出脂肪酶的Tm。軟件分析套用Boltzmann sigmoid公式，如下：

其中，F(xiàn)值為熒光強度值，t值指溫度，Bottom指測試窗口的低平臺，Top指測試窗口的高平臺，Slope指曲線的陡度。所謂測試窗口的低 (高) 平臺是指S型曲線中與橫坐標軸近似平行的平穩(wěn)部分。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶與ANS的熒光發(fā)射光譜

為探討ANS與脂肪酶結(jié)合后熒光光譜的變化，將脂肪酶液在不同溫度下 (25 ~65℃ ℃) 處理，與ANS混合后用熒光分光光度計測出熒光強度值。結(jié)果顯示：低溫 (25 ~35℃ ℃) 處理的脂肪酶與ANS結(jié)合后不會引起熒光強度的明顯變化，最大波長出現(xiàn)在450 nm處 (圖1A)。高溫 (40 ~65℃ ℃) 處理的混合液的最大發(fā)射波長由450 nm移至465 nm處，紅移[4]約15 nm，且伴隨著熒光強度的大幅提高。如65 ℃處理的脂肪酶與 ANS結(jié)合后的熒光強度約為25 ℃處理脂肪酶-ANS的6倍 (圖1)，熒光強度的變化幅度可產(chǎn)生足夠大的測試窗口。

2.2 ANS法測定脂肪酶Tm的影響因素

2.2.1 脂肪酶純度對ANS法測定Tm的影響

本實驗采用的脂肪酶是畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵表達的脂肪酶，表達產(chǎn)物單一，脂肪酶占 95%[5]以上，SDS-PAGE電泳呈單一條帶，但發(fā)酵液含有色素。分別利用ANS法對發(fā)酵上清、脫色素粗酶液、純酶液 (蛋白濃度均采用 0.2 mg/mL) 進行了Tm值測定。結(jié)果顯示：純酶液和脫色素粗酶液的測試窗口 (曲線高熒光值平臺-低熒光值平臺) 較大，測出的Tm值分別為38.81 ℃和38.76 ℃，與NaOH滴定(38.7 ℃) 和橄欖油檢驗板測定殘余酶活的結(jié)果一致。發(fā)酵上清的測試窗口較小，測出的Tm為42.19 ℃(圖2A)。明顯高于NaOH滴定和橄欖油檢驗板的測定結(jié)果。因此，應(yīng)采用脫色素粗酶液或純酶液來進行Tm的測定。而畢赤酵母發(fā)酵表達的酶液脫色素只需要通過少量的吸附色素的凝膠，簡單快速，可設(shè)置高通量方法快速完成。

圖1 脂肪酶-ANS熒光發(fā)射光譜分析. (A) 脂肪酶 (25 °C, 30 min). (B) 脂肪酶 (65 °C, 30 min)Fig. 1 Emission spectrum of lipase-ANS fluorescence. (A) Lipase (25 °C, 30 min). (B) Lipase (65 °C, 30 min). Curve 1 and 1’, 2 and 2’, 3 and 3’are represent the fluorescence emission spectrum of lipase-ANS, lipase, ANS.

圖 2 脂肪酶純度對 Tm測定值的影響. (A) 脂肪酶-ANS測定. (B) 橄欖油檢驗板測定Fig. 2 Effect of the enzyme purity on Tmmeasurement. (A)Lipase-ANS assay. (B) Olive oil agar plate assay. a: culture supernatant; b: dye removed culture supernatant; c: purified lipase.

2.2.2 色素對ANS法測定Tm的影響

為探討色素對ANS法測定結(jié)果的影響，本研究分別測定了含色素酶液 (PEL發(fā)酵上清用硫酸銨沉淀濃縮得到的酶液) 和脫色素的酶液 (含色素酶液通過脫色素柱處理后得到的酶液) 的Tm值。結(jié)果顯示：大量色素存在的條件下，熒光值明顯增高，Tm值為53.89 ℃，大大高于NaOH酶活測定等其他方法測出的 Tm。去除色素后，測定的脂肪酶的 Tm值為 38.80 ℃ (圖 3A)，與 NaOH滴定法 (38.7 ℃) 及橄欖油平板法 (圖3B) 的測試結(jié)果相符合。可見，發(fā)酵液含有的色素對脂肪酶Tm的測定有很大的影響。

2.2.3 脂肪酶蛋白和ANS濃度對ANS法測定Tm的影響

圖3 色素對ANS法測定脂肪酶Tm的影響. (A) 脂肪酶-ANS測定. (B) 橄欖油檢驗板測定Fig. 3 Effect of dye on Tmmeasurement with ANS assay. (A)Lipase-ANS assay. (B) Olive oil agar plate assay. a: lipase without dye; b: lipase with dye.

為探討ANS法采用的脂肪酶蛋白和ANS的濃度，將反應(yīng)體系的ANS濃度固定為0.04 mmol/L，變化脂肪酶濃度；將脂肪酶濃度固定為0.2 mg/mL，變化 ANS濃度，進行脂肪酶 Tm值的測定。結(jié)果表明：在蛋白濃度為0.29 mg/mL，0.145 mg/mL，0.0725 mg/mL，0.058 mg/mL，0.0029 mg/mL時，測試窗口分別為3 643、1 657、792、618、270，Tm值分別為 38.89 ℃、38.98 ℃、39.05 ℃、40.08 ℃、42.09 ℃ (圖4A)?？梢姡河肁NS法測定Tm時，蛋白濃度為0.145~0.29 mg/mL時可以獲得較大的測試窗口和得出準確的Tm。因此決定在以后的反應(yīng)體系中采用的脂肪酶濃度為0.2 mg/mL。

當固定脂肪酶蛋白濃度為0.2 mg/mL，ANS的濃度為 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.16 mmol/L時，測試窗口分別為 1 451、2 647、3 037、3 572、5 101、4 038、4 132、3 970，Tm值分別為 38.65 ℃、38.73 ℃、38.77 ℃、38.79 ℃、38.78 ℃、38.83 ℃、38.20 ℃、38.15 ℃ (圖 4B)。可見，ANS的濃度為0.01~0.16 mmol/L時，測出的Tm值相近，當ANS濃度為0.05 mmol/L時，可產(chǎn)生相對最大的測試窗口。因此，當固定脂肪酶蛋白濃度為0.2 mg/mL時，ANS的濃度采用0.05 mmol/L。

圖4 脂肪酶濃度 (A) 和ANS濃度 (B) 對ANS法測定脂肪酶Tm的影響Fig. 4 Effect of lipase and ANS concentration on Tmmeasurement with ANS assay. (A) Effect of lipase concentration on assay. (B) Effect of ANS concentration on assay.

2.2.4 NaCl濃度對ANS法測定Tm的影響

純化保存和進行測定的過程中，酶液一般是存在于含有一定濃度的NaCl的緩沖液中。為探討NaCl濃度對ANS法測定Tm的影響，在含0~1 000 mmol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.2) 的反應(yīng)體系中加入不同溫度溫浴的 0.2 mg/mL的純酶液和0.05 mmol/L的ANS，測定脂肪酶的Tm值。

結(jié)果顯示 (圖5)：當反應(yīng)體系中加入0、100、200、500、1 000 mmol/L的NaCl時，測試窗口分別為3 325、3 904、4 003、4 829、5 988，測試得出的脂肪酶Tm值分別為38.86 ℃、39.37 ℃、38.93 ℃，39.08 ℃、39.15 ℃。可見，反應(yīng)體系中的NaCl濃度對脂肪酶 Tm值的測定影響不大. 而一定量的 NaCl有利于測試窗口的增大。這一結(jié)果與用尼羅紅作熒光探針時顯示的結(jié)果[6]一致。

圖5 NaCl濃度對ANS法測定脂肪酶Tm的影響Fig. 5 Effect of NaCl on Tmmeasurement with ANS assay.

2.3 利用ANS法測定脂肪酶突變體的Tm值

根據(jù)上述結(jié)果我們確定了ANS法測定脂肪酶Tm值的方案如下：將發(fā)酵酶液去色素獲得脫色素酶液；將酶液在25 ℃~65 ℃下溫浴30 min；以0.05 mmol/L ANS，0.2 mg/mL脂肪酶，20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，pH 7.2為反應(yīng)體系，于378 nm激發(fā)波長，465 nm發(fā)射波長下測定熒光值；用GraphPad Prism數(shù)理統(tǒng)計與分析軟件分析出Tm值。

運用上述方法對野生型脂肪酶 PEL[5]和 5種突變脂肪酶 PEL-ep8-K115R、PEL-ep8-K202A[7]、PEL-K226R、PEL-PXD和PEL-ep8-K55R以及PEL3拷貝工程菌進行了 Tm值的測定。結(jié)果表明：ANS法測得的 Tm值 (圖 6A-G)：PEL 為 38.86 ℃；PEL-ep8-K115R為 42.14 ℃；PEL-ep8-K202A為43.63 ℃；PEL-K226R為 39.91 ℃；PEL-PXD為39.73 ℃；PEL-ep8-K55R為43.61 ℃；PEL 3拷貝工程菌為 38.38 ℃。與 NaOH的測定結(jié)果 (PEL為38.7 ℃，PEL-ep8-K115R 為 42.2 ℃，PEL-ep8-K202A為 41.66 ℃，PEL-K226R為 35.4 ℃，PEL-PXD為42.3 ℃，PEL-ep8-K55R 為 41 ℃，PEL 3lip為38.5 ℃)，和透明圈法測定結(jié)果相似 (圖6H)。

圖6 ANS法測定脂肪酶Tm值. (A?G) ANS測定. (H) 橄欖油檢驗板測定Fig. 6 Measurement of lipase Tmwith ANS assay. (A?G) ANS assay. (H) Olive oil agar plate assay. a: PEL-ep8-K115R; b:PEL-ep8-K202A; c: PEL; d: PEL-K226R; e: PEL-PXD; f: PEL-ep8-K55R; g: PEL-3lip.

圖7 讀板機和分光光度計測定的各脂肪酶的TmFig. 7 Comparison of lipases Tmmeasured with plate reader and photometer.

2.5 ANS法用于高通量脂肪酶Tm測定

以往采用的各種酶熱穩(wěn)定性測定一般都是一次只能測一個樣品的耗時和復(fù)雜的測定方法。為將ANS法測定脂肪酶熱穩(wěn)定性方法運用于高通量的穩(wěn)定性突變體篩選，本研究將溫浴處理的野生型脂肪酶PEL、突變體脂肪酶PEL-ep8-K202A和PEL-ep8-K115R和 ANS測定緩沖液混合后用 HITACHI F-4600熒光光度計 (一次讀取一個樣品) 和 Biotek synergy HT熒光讀板機 (同時讀取多個樣品) 分別讀取其熒光值。結(jié)果表明各突變體在兩種熒光值的讀取模式中得到了非常一致的結(jié)果，見圖7。因此，在進行高通量 Tm值測定時，可用讀板機取代HITACHI F-4600分光光度計進行ANS熱穩(wěn)定性測定的熒光值的讀取，從而實現(xiàn)在幾分鐘內(nèi)完成多達96個樣品的高通量分析。

3 小結(jié)

目前脂肪酶的熱穩(wěn)定性問題是生產(chǎn)實際和科學(xué)研究的研究熱點，穩(wěn)定性強意味著易保存 (保存期長)、運輸方便、使用效率高、意味著應(yīng)用范圍的擴大、也意味著低成本和高產(chǎn)出。酶熱穩(wěn)定性的高低常用酶活性半衰期和Tm值來衡量。酶活性半衰期是指在一定溫度下，酶活降低到原來一半時所需要的時間，即殘余酶活為50%時的時間。而Tm值指酶在不同溫度下溫浴一定時間后殘余酶活為50%時的溫度。目前脂肪酶熱穩(wěn)定性測定主要采用堿式(NaOH) 滴定法和平板透明圈法，NaOH滴定法測定熱穩(wěn)定性工作量巨大，測定幾個樣品的熱穩(wěn)定性要花上2~3 d，耗時耗力。此外，因測試時底物是乳化液，乳化液的乳化程度、滴定終點的判斷、滴定終點的讀數(shù)誤差等影響了其測量精確度。平板透明圈法的熱穩(wěn)定性測定的優(yōu)點在于直觀、操作簡便，但只是定性的方法，平板的厚薄、底物乳化分布均勻程度等，以及測量直徑時的人為誤差會影響到結(jié)果。本研究確立的ANS法測定脂肪酶的熱穩(wěn)定性是基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化來進行的，當酶蛋白受熱吸收能量后開始解折疊，內(nèi)部疏水基團暴露，導(dǎo)致ANS與暴露的疏水基團結(jié)合而發(fā)出強烈熒光。該方法靈敏度較高，實驗過程簡單，操作時間短，數(shù)據(jù)可信度較大，樣品需求量少，可用96孔板同時進行多個樣品的高通量的脂肪酶熱穩(wěn)定性測定，完成幾十個樣品的測定僅需幾小時。該方法的操作步驟簡單，樣品僅需簡單脫色素處理，從實驗結(jié)果看，該方法實驗誤差，重現(xiàn)性均好于以酶活測定為基礎(chǔ)的 NaOH滴定法。

通過對實驗影響因素：色素、底物濃度、緩沖體系中 NaCl離子強度等的研究，我們確立了 ANS脂肪酶熱穩(wěn)定性測定的反應(yīng)體系：100 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.2)，0.05 mmol/L ANS和0.2 mg/mL脂肪酶。設(shè)定激發(fā)波長為378 nm，發(fā)射波長465 nm，讀取熒光值，用GraphPad Prism數(shù)理統(tǒng)計與分析軟件分析結(jié)果。利用該方法我們測定了本實驗室的基因工程 PEL-GS野生型脂肪酶及其突變體的Tm。測定結(jié)果與傳統(tǒng)的NaOH滴定法和平板透明圈法的測試結(jié)果一致。

酶的熱穩(wěn)定性測定還常采用差示掃描量熱法(Differential scanning calorimetry，DSC)[8]、圓二色性法 (Circular dichroism，CD)[9-10]等方法，CD法和DSC法利用光學(xué)和熱學(xué)原理衡量脂肪酶的熱穩(wěn)定性，兩者均有專門的測試儀器，但這些方法無法一次完成很多樣品的測定，不能用于高通量的酶熱穩(wěn)定性測定。而ANS脂肪酶熱穩(wěn)定性測定法則是一種快速準確的、適合于短時間大量樣品高通量的熱穩(wěn)定性測定方法。

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Rapid and high throughput measurement of lipase thermo-stability through ANS fluorescence signal assay

Weizong Feng, Junhan Lin, Shaoli Cai, Youtu Zou, Guoren Chen, Ping Huang, Yajing Lin,Bingbing Wang, and Lin Lin
College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, China

Received: November 8, 2010; Accepted: January 26, 2011

Supported by: Industrial Microbe Collection and High Throughput Screening Platform Establishment (No. 2006H0085), Natural Science Foundation of Fujian Province (Nos. C0410009, B0120001), National Natural Science Foundation of China (No. 30270033).

Corresponding author: Lin Lin. Tel/Fax: +86-591-22868209; E-mail: benbo_00@yahoo.com

工業(yè)微生物高通量選育與保藏技術(shù)研發(fā)平臺建設(shè) (No. 2006H0085)，福建省自然科學(xué)基金 (Nos. C0410009, B0120001)，國家自然科學(xué)基金(No. 30270033) 資助。