類彈性蛋白多肽的從頭設計、非色譜純化及鹽效應

黃凱宗，李晶晶，李巍，葛慧華，王文研，張光亞

華僑大學生物工程與技術系，廈門 361021

類彈性蛋白多肽的從頭設計、非色譜純化及鹽效應

黃凱宗，李晶晶，李巍，葛慧華，王文研，張光亞

華僑大學生物工程與技術系，廈門 361021

旨在克隆、表達與純化類彈性蛋白多肽，并測定類彈性蛋白的相變溫度對不同的鹽敏感程度。從頭設計了類彈性蛋白多肽的序列并人工合成其編碼基因片段，克隆至改造后的表達載體pET-22b(+) 中，構建重組表達載體，轉化至大腸桿菌BL21(DE3) 中并誘導表達，采用可逆相變循環經高速離心對其進行純化，并考察了鹽類型及濃度對類彈性蛋白相變溫度的影響。結果表明：0.4 mmol/L的Na2CO3能使25 μmol/L類彈性蛋白多肽 [KV8F-20] 相變溫度降低至19 ℃，此類彈性蛋白多肽序列有望開發成一新型純化標簽，為今后重組蛋白的非色譜分離純化奠定基礎。

類彈性蛋白多肽，非色譜法純化，可逆相變循環，相變溫度，純化標簽

Abstract:Elastin-like polypeptides (ELPs) are temperature sensitive biopolymers composed of a Val-Pro-Gly-Xaa-Gly pentapeptide repeat that derived from a structural motif found in mammalian elastin. It was a promising tag for recombinant protein purification. Here, we de novo designed a novel ELPs gene and cloned it into the modified expression vector pET-22b(+). Then, we transformed the recombinant expression vector pET-22b-ELPs into Escherichia coli BL21(DE3). Upon induction by Isopropyl β-D-Thiogalactoside (IPTG), ELPs was expressed and purified by a non-chromatographic purification method named inverse temperature cycling. The influences of salts types and concentrations on ELPs were also determined. The results showed that the transition temperature of the [KV8F-20] decreased to 19 °C by 0.4 mmol/L Na2CO3. Due to its small molecular weight and sensitivity to salt, the ELPs might be a useful purification tag, which can provide a reliable and simple non-chromatographic method for purification of the recombinant protein by inverse transition cycling.

Keywords:elastin-like polypeptides, non-chromatographic purification, inverse transition cycling, transition temperature,purification tag

蛋白質分子大規模分離純化是當前生物工程中的關鍵技術問題，純化過程所需成本約占總成本的60%~70%，色譜法為目前分離蛋白較成熟的方法。融合標簽技術極大地簡化了重組蛋白質的純化過程，它通過融合一段特定的多肽 (如組氨酸標簽) 進行融合表達，并通過適當的親和力或者對配體有高特異性，融合蛋白可以與固相基質上的特異配基結合，從而使重組蛋白質得以純化[1]。但在實際應用中，親合色譜法成本很高，不僅需要特殊設備，須對固相基質進行定制，難以放大到工業規模，且純化效率低[2]。

類彈性蛋白多肽 (Elastin-like polypeptides，ELPs) 是一種具有彈性功能且對環境溫度非常敏感的人造基因工程蛋白質聚合物。其結構主要由五肽重復序列單元構成，即 (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，VPGXG)，源自于彈性蛋白的疏水區域，其中 Xaa可以是除 Pro以外任一氨基酸。ELPs有一個可逆相變過程，稱之為反轉變溫度 (Inverse temperature transition，ITT)，若環境溫度低于該相變溫度(Transition temperature)，該多肽在水溶液中為高度可溶，聚合物鏈保持無序結構，且相當伸展。相反，當溫度高于該溫度時，該含水的多肽鏈結構就瓦解，并開始聚集，形成一個富含 ELPs的聚集物，由于ELPs具有這種特殊性質，已廣泛應用于蛋白質純化與質粒DNA分離[3-8]。本研究設計了一新型ELPs (即ELP[KV8F-20])，人工合成其基因，成功在宿主菌表達并純化，同時測定其對鹽的敏感程度，為下一步純化重組蛋白提供了理論與實驗依據，報道如下。

1 材料與方法

1.1 ELPs的命名

ELP[XiYjZk-n] 代表整個ELPs序列中有n個五肽，五肽中第 4個氨基酸殘基組成比例為 X:Y:Z=i:j:k[2]。如ELP[KV8F-20]，是一個包含20個 VPGXG五肽單元序列，五肽單元第 4個氨基酸殘基組成為K、V、F，且五肽單元第4個殘基中含2個 K，16個V，2個F，比例為1:8:1。

1.2 菌株、質粒與培養基

表達宿主菌E. coli BL21 (DE3) 與pUC-19-ELPs及修飾后的pET-22b(+) 為本實驗室保存，表達載體pET-22b(+) 為上海捷瑞生物工程有限公司惠贈。的修飾過程為用替換原始 pET-22b(+) 的 NdeⅠ與 EcoRⅠ酶切位點之間的序列。

1.3 主要工具酶及試劑

限制性內切酶PflMⅠ、BglⅠ、NdeⅠ、EcoRⅠ與 SfiⅠ購自上海捷瑞生物工程有限公司，蛋白質Maker SM1861為Fermentas公司產品，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于碧云天生物技術研究所，聚乙烯亞胺購于Sigma公司，透析袋為美國聯合碳化公司產品，其他化學試劑均為分析純。

1.4 ELPs的原核表達載體構建

本文所涉及到的分子生物學技術，如感受態細胞的制備、轉化、質粒的提取和酶切等方法均參考文獻[9]。用 PflMⅠ與BglⅠ雙酶切pUC-19-ELPs，獲得 ELPs片段基因，將此片段基因插入到經 SfiⅠ酶切后 pET-22b(+) 修飾表達載體。重組質粒命名為pET-22b-ELPs，測序鑒定由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.5 ELP[KV8F-20] 表達與純化

含有pET-22b-ELPs重組質粒的BL21工程菌按1∶100的接種量接種到含100 μg/mL氨芐青霉素的TB培養基中 (每升TB培養基中含12 g蛋白胨，24 g酵母浸提物，2.31 g磷酸氫二鉀，12.54 g磷酸二氫鉀，4 mL甘油)，37 ℃、250 r/min培養至OD600為0.8時，加入IPTG誘導 (終濃度為1 mmol/L)，誘導 3 h，4 ℃、4 000 r/min離心 15 min，收獲菌體，用預冷的PBS緩沖液 (137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，4.2 mmol/L NaH2PO4，1.4 mmol/L KH2PO4，pH為7.3) 重懸菌體，然后置冰浴中超聲破碎 (超聲2 s，間隔2 s，共4 min)。

ELPs純化采用ITC (Inverse transition cycling，可逆相變循環)，即在大腸桿菌破碎液，向其加入聚乙烯亞胺 (終濃度為0.5%) 以去除核酸；4 ℃、13 000 r/min離心15min，取上清；向上清液中添加 NaCl 至終濃度為 2 mol/L，37 ℃水浴15 min后，13 000 r/min離心15 min，去上清；向沉淀中加入預冷的PBS 溶解沉淀，冰浴15 min后，4 ℃、13 000 r/min離心 15 min；向上清液中再添加NaCl至終濃度為 2 mol/L，37 ℃水浴 15 min后，13 000 r/min離心15 min，去上清；向沉淀中加入預冷的PBS溶解沉淀，冰浴15 min，4 ℃、13 000 r/min離心15 min，收集上清液，以上過程為兩輪ITC。ELPs的純度與分子量通過SDS-PAGE驗證。

1.6 ELP[KV8F-20] 的定量

采用紫外分光光計測定Trp在280 nm處的消光系數，建立標準曲線。測定ELP[KV8F-20] 在280 nm的消光系數，并與標準曲線進行比對，從而可以對ELPs濃度進行定量[10]。

1.7 ELP[KV8F-20] 相變溫度測定及鹽對其相變溫度影響的測定

測定ELP[KV8F-20] 相變溫度參考文獻[2]，即：測定 10 ℃~95 ℃ E LPs 的PBS溶液 (ELPs終濃度為25 μmol/L) 在波長為350 nm處的濁度，升溫速率為1 ℃/min。

鹽對 ELP[KV8F-20] 相變溫度影響的測定參考文獻[11]，即將鹽溶解在10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.9)，配制各種鹽的濃度梯度。將冷凍干燥后的 ELPs溶解于鹽濃度中，ELPs的終濃度為25 μmol/L，并測定其在波長為350 nm處不同溫度下的濁度。

1.8 相變溫度定義

相變溫度為OD350最大值的一半時所對應的溫度[2]。

2 結果與分析

2.1 PUC-19-ELPs的酶切及ELPs基因片段回收

依據 ELP[KV8F-20]的氨基酸序列 (100個氨基酸)，考慮大腸桿菌的密碼子使用情況，從頭設計其基因序列 (300 bp)，將其連入克隆載體pUC-19，經測序列，pUC-19-ELPs質粒構建正確。利用pflMⅠ與 BglⅠ對 ELP[KV8F-20]基因片段回收，回收結果如圖1所示，可見線性克隆載體片段與大小為300 bp的基因片段，符合預期大小；再將此基因導入到用SfiⅠ酶切修飾后的pET-22 b(+) 表達載體中[2]，構建pET-22 b(+)-ELPs表達載體，使用Nde I與EcoR I對該表達載體進行雙酶切鑒定，結果如圖2所示，可見線性表達載體片段和大小為 332 bp的基因片段，與預期結果一致；結合測序結果，表明表達載體構建正確。之后，將該pET-22 b(+)-ELPs導入到E. coli BL21 (DE3) 宿主菌中，構建工程菌。

2.2 ELPs的誘導表達與純化

圖1 pflM Ι與Bgl Ι酶切回收ELP基因Fig. 1 Recovery ELP gene with digestion by pflM I and Bgl I. 1: pET-22(b)-ELP digested by pflM I and Bgl I; 2: DNA marker.

圖2 重組pET-22(b)-ELPs的酶切鑒定Fig. 2 Identification of pET-22(b)-ELPs with digestion by Nde I and EcoR I. 1: pET-22(b)-ELPs digested by Nde I and EcoR I; 2: DNA marker.

含有 pET-22b(+)-ELPs重組質粒的 BL21工程菌，經IPTG誘導后，收集菌體，并細胞破碎后，采用ITC純化，純化結果表明在11 kDa處有一條帶，比 ELP[KV8F-20] 理論分子量大 20%，與相關的ELPs報道吻合[10,12]。

圖3結果表明，兩輪ITC之后，與細胞破碎液相比，目的蛋白質在純化的過程中并沒有太大損失，因而可認為 ITC可以保證目的蛋白回收率。由圖 4可知，經兩輪ITC之后，在11 kDa處有單一條帶，已達到純化目的，此外，ITC過程也是一個蛋白濃縮的過程。

圖3 表達純化的ELPsFig. 3 Expression and purification of the ELPs. 1: the purified ELPs after two rounds ITC; 2: the purified ELPs after one rounds ITC; 3: total proteins after induction; 4: protein marker.

圖4 使用足量與少量PBS溶解純化后ELPs沉淀Fig. 4 ELPs dissolved in adequate and small amount of PBS.1: protein marker; 2: purified ELPs were dissolved in adequate amount of PBS; 3: purified ELPs were dissolved in small amount of PBS.

2.3 ELPs相變溫度的測定及鹽對其相變溫度的影響

由圖5可知，在ELPs的相變發生階段，溫度上升2 ℃~3 ℃時，導致ELPs混濁度急劇的增加，關于ELPs相變機理，目前處于爭論階段，有一種觀點認為溫度升高，會破壞水分子與ELPs之間的水合作用，導致 ELPs溶解度驟變[11]。圖 6表明 ELPs的相變溫度與 ELPs的濃度呈反比關系，故 ELPs表達量越大，ELPs濃度越高，相變溫度越低，越有利于ELPs的純化。此外，ELPs的相變溫度與ELPs五肽重復序列單元中第 4個殘基 (Xaa) 的種類、ELPs序列長度、ELPs的分子量相關[13]。

圖5 含100 μmol/L的ELP[KV8F-20] PBS溶液的混濁度與溫度關系Fig. 5 Turbidity profiles for 100 μmol/L ELP[KV8F-20]concentration in PBS.

圖6 ELP[KV8F-20] Tt與濃度關系Fig. 6 Ttas a function of concentration for ELP[KV8F-20].

測定5種陰離子與3種陽離子對類彈性蛋白相變溫度的影響，依據霍夫邁斯特離子序[14](Hofmeister series)，陰離子陽離子本研究所考察3種陽離子及5種陰離子影響類彈性蛋白相變溫度順序。圖 8結果表明，5種陰離子的鈉鹽影響類彈性蛋白相變溫度順序均與霍夫邁斯特離子序相符合 (銨鹽與鉀鹽未列出，其影響趨勢與鈉鹽一致)。圖7結果表明，3種陽離子的硫酸鹽 (碳酸鹽、磷酸二氫鹽、氯化物、硝酸鹽影響 Tt趨勢與硫酸鹽一致) 對影響類彈性蛋白相變溫度順序卻為 NH4+＜K+＜Na+，造成這種差異，可能是本研究所設計的ELPs中含有苯丙氨酸殘基 (F) 與賴氨酸殘基 (K)有關，賴氨酸殘基的存在會使多肽產生屏蔽效應(Screening effects)，而F的存在會產生陽離子-π相互作用[11]。

圖7 三種硫酸鹽對ELP[KV8F-20] 相變溫度的影響Fig. 7 Transition temperature vs salt concentration curves for three sulfatets with ELP[KV8F-20].

圖8 五種鈉鹽對ELP[KV8F-20] 相變溫度的影響Fig. 8 Transition temperature vs salt concentration curves for five sodium salts with ELP[KV8F-20].

3 討論

類彈性蛋白多肽是一種具有彈性功能且對環境非常敏感的生物高分子，利用類彈性蛋白的可逆相變特性，使其在蛋白純化、作為藥物載體、組織工程等方面得到廣泛的應用[15]。

與類彈性蛋白進行融合表達的重組蛋白也具有可逆相變特性，因而也可以采用 ITC純化重組蛋白[16]。采用ITC純化蛋白有以下幾個優勢[17]：1)無需與色譜相關的色譜填料及設備，純化成本大幅度下降，這種純化方式可以規?；糯?(純化的蛋白量可以達到千克級別)；2) ITC的過程中分離與回收的條件較為溫和，只需適當改變溫度與離子強度；3) 采用ITC純化蛋白這種純化方式速度快，方法簡單，只需幾次離心步驟；4) ITC是很容易應用于到從不同的細胞發酵培養來純化蛋白，因為蛋白純化是制約蛋白質結構/功能研究與藥物篩選主要環節；5) ITC中的離心沉淀步驟也是一個蛋白濃縮富集過程，無需干燥；6) 目的蛋白回收率較高，采用ITC純化，回收率可以達到75%[18]。有研究者認為，這種純化方式將給重組蛋白的分離純化帶來革命性變化[16]。鑒于ITC純化蛋白簡單且快速性，有理由相信這種蛋白純化方式比較容易從實驗室規模放大到工業規模。

本研究從頭設計了一種新型的僅有 20個五肽單元的ELPs序列，通過考察不同鹽對其相變溫度影響，發現能大幅度降低相變溫度。雖然銨鹽也能顯著降低相變溫度，但是與鈉鹽相比，銨鹽加入會造成很多蛋白的鹽析，從而在目標蛋白中引入了更多的雜蛋白，對后續的分離純化不利[16]。與常規的ELPs相比 (如 ELP[V5]，ELP[V5A2G3]，ELP[V1A8G7])，本研究所設計的 ELPs蛋白質序列長度更短 (常規的ELPs序列一般至少需有60個以上五肽重復單元，才具有較低的相變溫度)[10]；對鹽濃度更為敏感；且賴氨酸的相對含量更低，這有助于提高蛋白質的表達量[18]并可能與ELPs產生的tT?(NaCl) 效應更低有關[2]。通過對鹽離子的進一步優化，此ELPs序列有望開發成一個新的重組蛋白純化標簽。

目前，國內鮮有 ELPs的研究報道[20]，而國外則相對較深入[15]。本研究所設計的 ELPs因其分子量較小，對鈉鹽非常敏感，產量較高，可望作為一種新型的純化標簽，為今后重組蛋白的分離純化帶來更多的選擇，相關的研究仍在不斷深入進行中。

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De novo design, non-chromatographic purification and salt-effect of elastin-like polypeptides

Kaizong Huang, Jingjing Li, Wei Li, Huihua Ge, Wenyan Wang, and Guangya Zhang
Department of Bioengineering and Biotechnology, Huaqiao University, Xiamen 362021, China

Received: June 13, 2010; Accepted: October 20, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 20806031), Natural Science Foundation of Fujian Province (No. 2009J01030).Research Foundation for Advanced Talents of Huaqiao University (No. 10BS220).

Corresponding author: Guangya Zhang. Tel: +86-595-22690290; E-mail: zhgyghh@hqu.edu.cn

國家自然科學基金 (No. 20806031)，福建省自然科學基金 (No. 2009J01030)，華僑大學高層次人才科研啟動項目 (No. 10BS220) 資助。