蒸汽爆破玉米秸稈酶解動力學

任省濤，程可可，宋安東，張建安

1 河南農業大學生命科學學院，鄭州 450002

2 清華大學核能與新能源技術研究院，北京 100084

蒸汽爆破玉米秸稈酶解動力學

任省濤1,2，程可可2，宋安東1，張建安2

1 河南農業大學生命科學學院，鄭州 450002

2 清華大學核能與新能源技術研究院，北京 100084

為了掌握蒸汽爆破玉米秸稈的酶解特性，研究了不同底物濃度、酶濃度、溫度對反應速率的影響。運用米氏方程對酶解動力學過程進行擬合，結果表明，纖維素酶對該玉米秸稈的水解反應在反應前3 h符合一級反應，可用米氏方程對其進行擬合。在轉速為120 r/min、酶濃度為1.2 FPU/mL、pH 5.0、溫度為45 ℃時米氏常數Km為11.71 g/L，最大反應速率Vm為1.5 g/(L·h)。確立了包括底物濃度、酶濃度、溫度在內的酶解動力學模型，該模型適合溫度為30 ℃~50 ℃。

米氏方程，玉米秸稈，酶解，動力學，纖維素酶

Abstract:In order to learn the enzymatic hydrolysis characteristics of steam-explosion pretreated corn straw by cellulase, the effects of substrate concentration, cellulase concentration and temperature were determined. The kinetics of the hydrolysis reaction could be described with the Michealis-Menten equation, and the hydrolysis reaction obeyed the classical first-order reaction rate in the first three hours. In the condition of 45 °C and pH 5.0 and the stirring rate 120 r/min, the Michealis constant (Km) and maximum rate (Vm) for 1.2 FPU/mL of cellulase were 11.71 g/L and 1.5 g/(L·h). The kinetic model, including the parameters such as substrate concentration, enzymatic concentration and temperature, was suit for the hydrolysis reaction under the temperature range from 30 °C?50 °C.

Keywords:Michealis-Menten equation, corn stover, enzymatic hydrolysis, kinetics, cellulase

最近幾十年內，全球變暖日益嚴重，溫室氣體特別是 CO2氣體的排放已經成為人類關注的焦點?；剂系娜紵钱a生溫室氣體的直接來源，已成為環境污染的主要根源[1-2]。化石燃料是不可再生資源[3]，隨著化石燃料的日益枯竭，許多國家都在積極探索新的能源以應對能源危機。生物質能源一直是人類賴以生存的重要資源，在整個能源系統中占據重要地位。我國生物質原料非常豐富，年產量約11.45億噸，其中秸稈就達7億多噸，玉米秸稈占到了35%，為我國能源問題提供了巨大的資源[4-5]。

但是由于植物本身對纖維素酶的抗逆性，直接利用纖維素酶酶解植物秸稈效率很低，一般進行預處理。其中，蒸汽爆破以對環境無污染、能耗低被認為是最有前景的預處理方式之一。通過蒸汽爆破預處理可使物料的結構變得分散，從而使纖維素得到充分暴露[6-8]，繼而有利于后續的酶解和發酵。纖維素類物質的酶解需要幾種纖維素酶的協調作用，是一個復雜的物理化學變化過程。其中包括一些物理的、動力學的和大量的轉化參數，并且有些情況下這些參數又是可變的，從而導致對纖維素酶酶解纖維素類物質的動力學模型的構建相當困難[9]。纖維素酶解動力學已經研究了將近50年，但是我們對于纖維素酶解動力學的認識仍然是不完善的，仍然不能對結果進行很好的預測。學術界關于纖維素酶酶解纖維素有很多分歧，有人認為酶解纖維素是一個不同纖維素酶的協調作用；有人認為纖維素類物質底物的結構、中間產物 (纖維二糖) 和終產物 (葡萄糖) 對酶解有抑制[10]。Nidetzky等[11]發現各種纖維素酶的協調作用起很重要的作用，在纖維素被綠色木酶復合物降解過程中，各個纖維素酶的吸附慢慢增加，不存在偏好性；而 Converse和 Optekar[12]認為纖維素外切酶更容易被吸附。Andric等[13]研究了葡萄糖在小麥秸稈酶解過程中的抑制作用，發現隨著葡萄糖濃度的增加抑制作用逐漸增強，特別是當葡萄糖初始濃度達到40 g/L時，發現在酶解的初期葡萄糖的濃度卻在下降，低于初始的 40 g/L，其認為是由于轉糖苷的作用；同時用滲透膜對酶解過程中的葡萄糖進行在線分離，從而使酶解速度大大提高。Kadam等[14]認為除了產物如葡萄糖、纖維二糖的抑制外，底物本身的一些性質也是影響酶解速率的一個重要原因，他的研究表明無定形纖維素的酶解速率是結晶纖維素的5~10倍，由此提出了關于底物本身特性的底物活力參數的概念，并構建了包括產物葡萄糖、纖維二糖和底物活力在內的模擬方程。Zheng等[15]用朗繆爾吸附方程模擬了木質素對纖維素酶酶解纖維素的負面影響，并構建了適用于底物濃度范圍為 4%~12%、酶加載量為 15~50 FPU/g纖維素的酶解反應方程。本研究采用蒸汽爆破預處理 (2.5 MP，10 min) 的玉米秸稈為底物，進行纖維素酶酶解實驗，研究了底物濃度、酶濃度、反應溫度對其酶解速率的影響，運用米氏方程并結合Arrhenius方程、范特霍夫方程模擬了包括溫度、底物濃度、酶濃度在內的酶解動力學模型，為酶解反應的進一步工藝優化提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米秸稈：取自鄭州北郊河南農業大學實驗農場，干燥并粉碎40~60目的玉米秸稈進行蒸汽爆破預處理 (2.5 MPa，10 min)。

纖維素酶：自制的纖維素酶，酶活為100 FPU/mL。酶活測定用DNS法。

1.2 方法

汽爆預處理后的玉米秸稈樣中，除含纖維素外，還含有多種水溶性抑制物，可能抑制酶解反應速率[16]。在研究酶解動力學前，先對樣品進行充分水洗，以洗脫抑制物。取水洗、干燥后的固體部分，加入所需的酶、水及緩沖液，最后定容為25 mL。用磷酸鹽緩沖液調pH為5.0。測前3 h的葡萄糖濃度變化情況，每樣2個平行，取平均值。

葡萄糖的測定：高效液相色譜測定。

色譜條件：色譜柱為 Aminex HPX-87H，流動相為0.005 mol/L硫酸，流速為0.8 mL/min，檢測器為RID-10A折光示差檢測器，柱溫為65 ℃，進樣體積為 20 μL。

葡萄糖的生成速率 (V) =生成的葡萄糖的含量/溶液體積/反應時間。

2 結果與分析

2.1 底物濃度對反應速率的影響

蒸汽爆破預處理的玉米秸稈經過水洗，取固體部分作底物，在溫度為45 ℃，轉速為120 r/min，底物濃度[S]分別為 5、10、20、30、40、50、60 g/L時進行酶解。由葡萄糖生成速率對數 (lnv) 對底物對數 (ln[S]) 作圖得到圖1所示直線，表明在反應開始 3 h內，纖維素酶降解玉米秸稈的反應遵循一級反應規律。由葡萄糖生成速率V對底物濃度[S]作圖得到圖 2，可以看出初始時由于隨著底物濃度的增加，酶的利用率也增加，表現為葡萄糖生成速率不斷增加；當底物達到一定值，酶完全與底物結合，此時葡萄糖生成速率達到最大值。此后盡管底物不斷加大，反應速率卻不再上升而是趨于平衡。曲線符合經典的米氏方程曲線，可以用米氏方程描述。

圖1 lnV與ln[S] 的關系圖Fig. 1 Relationship between lnV and ln[S].

圖2 反應速率與玉米秸稈濃度的關系圖Fig. 2 Relationship between reaction velocity and corn stover concentration.

Michealis-Menten 提出酶促反應步驟如下：

酶 (E) 與底物 (S) 結合形成中間產物 (ES)，中間產物分解成產物 (P)，從而酶重新游離出來。K1為 (ES) 生成的反應速率常數，K2、K3分別代表(ES) 的分解反應速率常數。K4為 (E)+(P) 復合生成(ES) 的反應速率常數。在反應初期，由于產物P的濃度很低，不足以引起可逆反應，K4可以忽略，因此 (ES) 的形成速率可以寫為

開始時底物濃度遠遠大于酶濃度，即[S]遠大于[E]，因此被酶結合的底物[ES]可以忽略。所以[S]?[ES]≈[S]

[ES]的分解速率為

根據反應動態平衡，可知[ES]的形成速率跟分解速率相等。

得出動態平衡時的[ES]

因為酶反應速率V與[ES]成正比，所以V=K3[ES]將 (3) 代入得

運用Lineweaver-Burk法，以1/V對1/[S]作圖，得到圖 3，用最小二乘法線性擬合，可以得到 Vm=1.50 g/(L·h)，Km=11.71 g/L。

回歸方程

方程的相關系數r=0.998，表明差異極顯著。

圖3 纖維素酶水解玉米秸稈的Lineweaver-Buck圖Fig. 3 Lineweaver-Buck plots for corn stover hydrolyzed with cellulose.

高培基等[17]用純纖維素粉為酶解底物，得到酶解初速度為12 g/(L·h)，遠遠高于蒸汽爆破預處理玉米秸稈為底物所進行的酶解初速度?？赡苁且驗殡m然蒸汽爆破使秸稈中的纖維素得到了有效的分離，但是仍然有部分纖維素被半纖維素和木質素包裹；此外不溶的木質素和蒸汽爆破產生的一些抑制物也是產生酶解初速度偏低的原因。

Kadam等[14]認為決定酶解初速度高低的主要原因是底物的無定形區所占的比例。

2.2 酶濃度對反應速率的影響

在溫度為45 ℃，轉速為120 r/min，底物濃度為60 g/L，反應液酶濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 FPU/mL時進行酶解，酶濃度與反應速率的關系如圖4所示。

圖4 反應速率與酶濃度的關系圖Fig. 4 Relationship between reaction velocity and enzyme concentration.

從圖 4可以看出，隨著酶濃度的增加，反應速率與酶濃度基本呈線性關系，反應速率與酶濃度呈正比。當酶促反應體系的溫度、pH不變，底物充分過量的情況下，酶量越大，則生成的產物越多，反應速率就越快?？梢杂妹复俜磻獧C理解釋，有方程 (3) 可以寫為=K[Et]，在底物濃度極大時，[S]在反應過程中的改變量很小，K=K3[S]/(Km+[S])可視為常數，因此反應速率V正比于[Et]，兩者呈線性關系，與實驗結果相符。Linda等[18]用蒸汽預處理的小麥秸稈作底物，酶的加載量分別為3、6、12、14 FPU/g小麥秸稈，發現隨著酶濃度的增加，反應速率依次增加，與本實驗所得結果一致。

2.3 溫度對反應速率的影響

在底物濃度為50 g/L，轉速為120 r/min，溫度分別為30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃時進行酶解，反應溫度與反應速率見圖5。隨溫度的升高，酶解速率也隨著升高。這一現象與酶促反應的規律相吻合，即在一定范圍內，溫度升高，酶促反應速率加快。

用lnV對1/T (×103K?1) 作圖 (T為華氏溫度，K) 如下，運用最小二乘法線性回歸可以得到如圖6所示直線，可見，lnV在30 ~50 ℃℃范圍內與溫度倒數呈線性關系，表明纖維素酶降解玉米秸稈反應的反應速率隨溫度的變化符合Arrhenius方程

圖5 反應速率與溫度的關系圖Fig. 5 Relationship between reaction velocity and temperature.

圖6 lnV與1/T關系圖Fig. 6 Relationship between lnV and 1/T.

變為指數形式為：V=A×exp(?Ea/RT)

通過線性回歸方程求得Ea=38.56 kJ/mol，指前因子 A=14.42 g/(L·h)。統計檢驗的相關系數r2=0.982，表明 Arrhenius方程對本研究數據的擬合是極顯著的。余洪波等[19]以白腐菌生物-堿氧化預處理的玉米秸稈作底物，運用響應面分析了包括溫度、pH、轉速在內的纖維素酶解反應。結果表明溫度在49 ℃，pH為4.8，轉速為200 r/min時酶解反應結果最好。Oh等[20]研究了酶解溫度為30 ℃~50 ℃的酶解情況，結果顯示隨著溫度的升高，酶解初速率也依次增高，得到活化能為43.6483 kJ/mol，本實驗結果與之接近。

平衡常數Ks與溫度T的關系，服從范特柯夫方程

酶促反應K3>>K2，Ks≈Km，以不同溫度梯度下測定的米氏常數Km回歸求得焓度H?=14.424 kJ/mol，頻率因子 C=2.498×103。統計相關性 r=0.975。由此確立纖維素酶水解蒸汽預處理玉米秸稈的酶解動力學模型方程為：

3 結論

纖維素酶酶解蒸汽爆破預處理玉米秸稈的前3 h，反應遵循一級反應規律，可以用米氏方程進行模擬。用雙倒數法和最小二乘法進行線性回歸，得到米氏常數Km為11.71 g/L，最大反應速率Vm為1.5 g/(L·h)。

附錄

[Et]：總的酶量

[ES]：酶與底物所形成的中間產物的濃度

[Et]?[ES]：游離狀態的酶的濃度

[S]：底物濃度

B：積分常數

R：氣體常數，J/(mol×K)

Ea：活化能，kJ/mol

A：指前因子，g/(L·h)

Ks：平衡常數

? H ：焓度，kJ/mol

C：頻率因子

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Kinetics of enzymatic hydrolysis of steam-explosion pretreated corn straw

Shengtao Ren1,2, Keke Cheng2, Andong Song1, and Jian’an Zhang2
1 College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
2 Institute of Nuclear and New Energy Technology, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Received: June 28, 2010; Accepted: October 20, 2010

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA100702-3), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB707406).

Corresponding author: Jian’an Zhang. Tel/Fax: +86-10-89796086; E-mail: zhangja@tsinghua.edu.cn

國家高技術研究發展計劃 (863計劃) (No. 2007AA100702)，國家重點基礎研究發展計劃 (973計劃) (No. 2011CB707406) 資助。