雞法氏囊B淋巴細胞中與雞傳染性法氏囊病病毒VP2相互作用蛋白篩選

高玉龍，孫芬芬，侯磊，高宏雷，祁小樂，劉娣，華育平，王笑梅 黑龍江省農業科學院博士后工作站，哈爾濱 50086 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室，哈爾濱 5000 東北林業大學博士后流動站，哈爾濱 50040

雞法氏囊B淋巴細胞中與雞傳染性法氏囊病病毒VP2相互作用蛋白篩選

高玉龍1,2,3，孫芬芬2，侯磊2，高宏雷2，祁小樂2，劉娣1，華育平3，王笑梅2
1 黑龍江省農業科學院博士后工作站，哈爾濱 150086
2 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室，哈爾濱 150001
3 東北林業大學博士后流動站，哈爾濱 150040

為了獲得雞法氏囊B淋巴細胞中與雞傳染性法氏囊病病毒 (IBDV) VP2相互作用的蛋白質，利用酵母雙雜交系統，用IBDV VP2蛋白為誘餌蛋白，篩選雞法氏囊B淋巴細胞cDNA表達文庫。將表達文庫質粒轉化含IBDV VP2誘餌質粒的酵母感受態細胞，檢測報告基因在相應的營養缺陷型培養基 (SD/-Leu/-Trp/-His) 上表達情況，進一步經β-半乳糖苷酶報告基因檢測，篩選到16個陽性克隆。提取陽性克隆質粒，經測序分析獲得5個原雞基因序列，分別是：線粒體DNA、蛋白質O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化轉移酶、腫瘤蛋白p53結合蛋白、微管解聚相關蛋白質和軟骨蛋白硫酸GalNAcT-2。Co-IP試驗進一步證實VP2蛋白能夠與腫瘤蛋白p53結合蛋白、蛋白質O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化轉移酶和軟骨蛋白硫酸蛋白相互作用。為研究IBDV與宿主細胞相互作用以及細胞受體篩選奠定了基礎。

傳染性法氏囊病病毒，B淋巴細胞，cDNA表達文庫，蛋白相互作用，酵母雙雜交

Abstract:To screen the interactive proteins with IBDV Gt VP2 protein from cDNA library of B Lymphoid cells of the bursa of fabricius. The expression cDNA library plasmids was transformed to the yeast competent cells, which have the bait plasmid-Gt VP2. After testing for growth in synthetic complete medium lacking histidine and uracil and for production of β-galactosidase(X-gal), we obtained 16 positive clones. We searched the gene sequences of positive clones in the NCBI website. The blast results showed that five positive clones were the gallus sequences. They were Gallus gallus breed mitochondrial DNA, O_GlcNAc transferase, Tumor protein p53 binding protein, Stathmin and Chondroitin sulfate GalNAcT-2, respectively. This study is helpful for the further identifying the receptors of IBDV in B Lymphoid cells of the bursa of fabricius.

Keywords:infectious bursa disease virus (IBDV), B Lymphoid cells, cDNA expression library, protein-protein interactions, yeast two-hybrid system

雞傳染性法氏囊病 (Infectious bursal disease，IBD) 是由雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV) 引起的一種急性、高度接觸性、病毒性傳染病。IBDV屬于雙 RNA病毒科(Birnaviridae) 禽雙RNA病毒屬 (Avibirnavirus)。法氏囊是IBDV感染宿主及其復制的組織基礎，IBDV的易感細胞為法氏囊B淋巴細胞，IBDV感染雞后，首先在法氏囊B淋巴細胞中復制、增殖，進而引起發病，導致嚴重的免疫抑制[1]，以致誘發多種疾病或引起多種疫苗免疫失敗[2-4]。

VP2蛋白是IBDV的主要宿主保護性抗原，具有一個構象依賴性的中和抗原決定簇，可誘導機體產生中和抗體，是病毒的主要衣殼蛋白，構成病毒的外表面，決定病毒毒力和細胞嗜性[5-6]。研究發現，VP2蛋白的206~350位氨基酸是影響病毒與細胞受體相互作用的位點[7]，所以推測其與宿主細胞作用及病毒感染有密切關系[8]。對IBDV的晶體結構研究表明，幾個嗜性決定簇定位于VP2蛋白頂端，暴露于最外側，推測這些氨基酸殘基直接與細胞受體相互作用[9]。為了研究IBDV與宿主細胞的相互作用，篩選法氏囊B淋巴細胞上與VP2蛋白相互作用的蛋白，本研究利用酵母雙雜交系統，以IBDV Gt VP2蛋白為誘餌蛋白，從雞法氏囊B淋巴細胞cDNA表達文庫中篩選與其相互作用的蛋白質分子，為鑒定IBDV細胞受體、研究IBDV與宿主細胞相互作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株及主要試劑

酵母雙雜交表達載體 pDESTTM32、Mav203酵母菌株、鮭魚精 DNA、酵母質粒小提試劑盒、BP ClonaseTMEnzyme Mix、LR ClonaseTMEnzyme Mix均購自美國 Invitrogen公司；各種營養缺陷型培養基、X-gal、二甲基甲酰胺 (DMF)、3-Aminotriazole(氨基三唑) 購自 Clontech公司；大腸桿菌 E. coli DH5α為本實驗室保存；pMD18-T、2×HotStart Taq PCR MasterMix購自TaKaRa公司。HRP標記羊抗鼠IgG二抗、硝酸纖維素膜、Flag單克隆抗體均購自Sigma公司。

1.2 酵母感受態制備及文庫質粒轉化

攜帶有 IBDV VP2誘餌質粒 (pDESTTM32-GtVP2) 的酵母菌Mav203為本實驗室構建保存[10]。接種該菌株于 250 mL 三角燒瓶中，加 20 mL SD/-Leu液體培養基，30 ℃過夜培養。次日稀釋至300 mL SD/-Leu液體培養基中 (OD600=0.1)，繼續搖至OD600=0.5。室溫下2 500 r/min離心8 min，棄上清；30 mL無菌水重懸沉淀，室溫下2 500 r/min離心 5 min，棄上清。沉淀懸于 1.5 mL 1×乙酸鋰(LiAc)/0.5×TE，室溫孵育10 min。將上述感受態細胞懸液分裝到30個1.5 mL EP管中，每管50 μL。加1 μg表達文庫質粒[11]和5 μL高質量滅活的鮭魚精 DNA 于每個 EP管中，加 300 μL 1×LiAc/40%PEG-3350/1×TE到每管，30 ℃水浴30 min。每管中加 40 μL 二甲基亞砜 (DMSO)，42 ℃作用 10 min。將30管轉化菌液分別涂布于30個15 cm SD/-Trp/-Leu/-His/30 mmol/L 3AT平板，30 ℃培養4 d，待酵母菌長到3 mm左右備用。

1.3 β-半乳糖苷酶 (X-gal) 活性的檢測

觀測轉化平板上陽性克隆的生長，其間逐步將生長出的陽性克隆全部劃線到 SD/-Trp/-Leu篩選平板上，同時每個平板分別設強陽性、弱陽性和陰性對照酵母菌，制作Master平板，30 ℃培養24 h。然后將其轉印到滅菌NC膜上，將膜放入YPAD平板上，30 ℃培養 18~24 h。稱取 10 mg X-gal溶于 100 μL DMF，加 60 μL β-巰基乙醇和 10 mL Z buffer，取 2層直徑為125 mm的濾紙浸入上述溶液，將多余的液體吸出。將長出菌落的NC膜置于液氮中10~30 s后取出恢復至室溫，將其平鋪在浸泡有 X-Gal緩沖溶液的濾紙上，放于37 ℃溫箱孵育過夜。將呈現藍色的克隆在 SD/-Trp/-Leu選擇平板上連續劃線培養1次后，再次進行X-gal試驗以進一步排除假陽性。

1.4 陽性克隆鑒定及基因信息分析

對X-gal試驗為陽性的酵母菌，從Master板上挑菌搖于5 mL的SD/-Trp/-Leu液體培養基中，用酵母質粒小提試劑盒提取酵母質粒。取5 μL質粒，用相應載體引物進行PCR擴增，擴增產物膠回收后連接到 pMD18-T載體上，挑取陽性克隆進行序列測定。利用Blast分析基因信息。

1.5 相互作用蛋白Co-IP驗證

分別將酵母雙雜交篩選到的候選基因克隆到pCAGGS的多克隆位點，構建真核表達質粒，其C末端引入Flag標簽，同時構建IBDV VP2基因的真核表達質粒。經酶切鑒定及測序正確的陽性克隆，提取質粒后分別與VP2真核質粒共轉染Vero細胞，培養48 h后，用700 μL細胞裂解液裂解細胞，4 ℃、12 000 r/min離心7 min，吸取上清置一新的EP管中，加入10 μL Protein G后，加抗VP2單克隆抗體7 μL，4 ℃低速旋轉過夜，次日4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL裂解液重懸，離心后棄上清，加入15 μL 2×SDS上樣緩沖液，運行SDS-PAGE后轉印到NC膜，用抗Flag單克隆抗體作為一抗，二抗用HRP標記的抗鼠IgG二抗，進行Western blotting分析。

2 結果與分析

2.1 雞法氏囊B淋巴細胞cDNA文庫篩選

將cDNA表達文庫質粒轉化入Mav203酵母菌(含有誘餌質粒pDESTTM32-VP2)，在SD/-Trp/-Leu/-His/30 mmol/L 3AT篩庫平板上有200多個陽性克隆，將生長出的陽性克隆全部接種到SC-Trp-Leu營養缺陷型平板制作Master板，生長3~4 d后，進行X-gal顯色反應，初步篩到16個陽性克隆，見圖1。

圖1 X-gal藍斑顯色試驗結果Fig. 1 Results of LacZ reporter gene.

2.2 陽性克隆的PCR鑒定

將X-gal篩選的16個陽性克隆用酵母質粒小提試劑盒提取質粒，并用Prey質粒重組位點兩端引物進行PCR擴增，以0.8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，結果表明從 1、2、3、4、10和12號質粒共擴增得到6個不同的基因片段 (圖2)，其他質粒為假陽性。

2.3 陽性克隆測序及基因信息分析

將PCR擴增產物克隆到pMD18-T載體進行序列測定，測序結果進行Blast同源性比對。結果發現，篩選到的文庫質粒cDNA插入片段均為已知原雞序列，與原雞序列同源性均在99%以上。其中4號和12號質粒為同一個基因，是原雞線粒體DNA。其他基因編碼不同蛋白，詳細結果見表 1。對這 5個蛋白進行了跨膜結構預測分析，結果表明 5個蛋白均沒有跨膜區，其中軟骨蛋白硫酸GalNAcT-2存在一個信號肽區。

圖2 酵母質粒PCR電泳圖Fig. 2 PCR products of yeast positive plasmids. 1: No. 10 plasmid; 2: negative control; 3: No. 12 plasmid; 4: No. 1 plasmid; 5: No. 4 plasmid; 6: No. 2 plasmid; 7: No. 3 plasmid;8: pDEST22 control; M: 1 kb DNA marker.

表1 法氏囊B淋巴細胞中與IBDV VP2蛋白相互作用蛋白生物學信息Table 1 Biology information of proteins of B lymphocyte of bursa interacting with IBDV VP2

2.4 Co-IP試驗結果

免疫共沉淀試驗可用于檢測蛋白之間的相互作用，為了進一步驗證酵母雙雜交篩選到的候選蛋白與IBDV VP2蛋白相互作用，分別構建了帶Flag標簽的真核表達質粒，分別與VP2共轉染Vero細胞后進行Co-IP檢測，結果見圖3。腫瘤蛋白p53結合蛋白 (泳道1)、蛋白質O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化轉移酶 (泳道2) 和軟骨蛋白硫酸GalNAcT-2 (泳道4)均出現了與預期大小一致的蛋白條帶，表明VP2蛋白可以分別與它們作用，將其沉淀下來，而VP2蛋白不能沉淀微管解聚相關蛋白 (泳道5)。

圖3 免疫共沉淀檢測結果Fig. 3 Results of Co-IP assay. 1: tumor protein p53 binding protein+VP2; 2: O_GlcNAc+VP2; 3: marker; 4: chondroitin sulfate GalNAcT-2+VP2; 5: stathmin+VP2; 6: vero cell only; 7:VP2 only.

3 討論

病毒能否吸附到相應的細胞是該病毒能否完成感染的關鍵環節。病毒與細胞特異性結合的本質是病毒蛋白(配體)與細胞膜表面特定蛋白 (受體) 的特異性結合[12]。病毒粒子上與細胞受體結合的蛋白質 (配體)，一般都是病毒表面蛋白。VP2蛋白是IBDV的主要衣殼蛋白，構成了 IBDV的外表面。IBDV的配體主要集中在VP2蛋白，推測其與宿主細胞作用及病毒感染有密切關系[12]。所以本研究選取IBDV VP2蛋白為誘餌蛋白來篩選雞法氏囊B淋巴細胞 cDNA表達文庫。希望從中篩選到與 IBDV相互作用的蛋白，為研究病毒與宿主細胞相互作用以及IBDV細胞受體篩選奠定基礎。

本研究利用酵母雙雜交系統從雞法氏囊B淋巴細胞cDNA表達文庫中篩選到16個陽性克隆，經反復篩選及序列測定得到5個不同的候選基因，均為原雞序列。它們分別為線粒體 DNA (Gallus gallus breed mitochondrial DNA)、蛋白質O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化轉移酶 (O_GlcNAc transferase)、腫瘤蛋白 p53結合蛋白 (Tumor protein p53 binding protein)、微管解聚相關蛋白質 (Stathmin) 和軟骨蛋白硫酸GalNAcT-2 (Chondroitin sulfate GalNAcT-2)。腫瘤蛋白 p53是一種核蛋白，其在調控細胞周期中起重要作用。該蛋白包含DNA結合寡聚化域和轉錄激活域，腫瘤蛋白 p53蛋白與結合位點結合后，形成四聚體結構，激活下游基因的表達，從而抑制細胞生長[13]。軟骨蛋白硫酸 GalNAcT-2廣泛分布于高爾基體中，其能與金屬離子結合，具有轉移酶功能[14]。微管解聚相關蛋白 (Stathmin)，是脊椎動物細胞中普遍存在的胞質內可溶性磷蛋白，能夠高效調節細胞的增殖與分化[15-16]。蛋白質 O_GlcNAc糖基化轉移酶促進蛋白質的O-GlcNAc糖基化，在蛋白質-蛋白質相互作用的調節中發揮著重要的作用[17]。

為了進一步在體外驗證這些蛋白與 IBDV VP2蛋白的相互作用，本試驗又分別構建了真核表達質粒，進行了Co-IP試驗，結果表明VP2蛋白能夠將腫瘤蛋白p53結合蛋白、蛋白質O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化轉移酶和軟骨蛋白硫酸蛋白沉淀下來，進一步證實了它們能夠相互作用。而與微管解聚相關蛋白的Co-IP試驗，我們重復了3次，VP2蛋白均不能將其沉淀下來，推測這兩個蛋白不能夠相互作用，酵母雙雜交結果可能為假陽性。

跨膜結構預測分析表明這幾個蛋白均沒有跨膜區，不是膜蛋白，那么這些蛋白是怎樣與IBDV VP2蛋白相互作用、在IBDV感染B淋巴細胞中充當什么角色還不清楚，還有待于進一步研究。

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Screening proteins interacting with infectious bursa disease virus Gt VP2 from cDNA library of B lymphoid cells of the bursa of fabricius

Yulong Gao1,2,3, Fenfen Sun2, Lei Hou2, Honglei Gao2, Xiaole Qi2, Di Liu1, Yuping Hua3,and Xiaomei Wang2
1 Postdoctoral Research Center, Heilongjiang Academy of Agriculture Science, Harbin 150086, China
2 State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001, China
3 Postdoctoral Research Station, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China