一株產紫杉醇內生真菌的分離及鑒定

梁盛年

（肇慶學院 生命科學學院，廣東 肇慶 526061）

一株產紫杉醇內生真菌的分離及鑒定

梁盛年

（肇慶學院 生命科學學院，廣東 肇慶 526061）

從中國南方紅豆杉三齡樹樹皮中分離得到內生真菌ZU07，經液體發酵，用高效液相色譜技術對該真菌的發酵液提取物進行了分析，結果表明菌株ZU07能合成抗癌藥物紫杉醇，其紫杉醇含量約為214．45 μg/L．

中國南方紅豆杉;紫杉醇;內生真菌;高效液相色譜法

紫杉醇（Paclitaxel，商品名為Taxol）是迄今為止發現的最有效的抗癌藥物之一．臨床試驗結果表明，紫杉醇對治療婦科腫瘤（包括卵巢上皮癌和乳腺癌）效果較好，對其他腫瘤（如肺癌、前列腺癌、食道癌等）也顯示出良好的治療前景[1]．然而紫杉醇藥源不足極大地限制了其在臨床中的應用，開辟新的紫杉醇來源一直是國內外的研究熱點．Strobel G[2]首次從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）中分離得到可產生紫杉醇的內生真菌，這一發現開辟了生產紫杉醇的新途徑．其后，不斷有文獻報道從不同種的紅豆杉樹上分離出能產紫杉醇的內生真菌[3－8]，但那些紅豆杉樹的樹齡均在幾十年甚至百年以上，并且因生態環境不同，分離所得的內生真菌產出紫杉醇的能力亦不同，野生菌株產出紫杉醇普遍在200 μg/L以下[9]．產率最高的是周東坡等[6]組建的一株工業菌株，產率為448．52 μg/L，均未達到工業化生產的要求（工業化生產要求紫杉醇的產量要達到1 mg/L以上）．本文中，筆者以生長在肇慶北嶺山(地處北回歸線帶上，靠近廣東著名的鼎湖山)的中國南方紅豆杉（Taxus mairei）三齡樹為材料，進行了產紫杉醇的內生真菌分離研究，旨在從中分離出高產率的產紫杉醇的內生真菌，以期為我國在世界上爭取和利用微生物資源創造有利條件．

1 實驗材料和實驗方法

1．1 實驗材料與設備

1)紅豆杉：采自生長于肇慶北嶺山的三齡中國南方紅豆杉（Taxus chinensis var．mairei）．

2)培養基：根據需要采用固體和液體2種培養基．

分離時選用PDA固體培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為6．8．配制方法是將馬鈴薯去皮切碎，水煮30 min；用2～3層紗布過濾，溶入葡萄糖及瓊脂后加水定容．在121℃的溫度下滅菌20 min，冷卻至60～70℃時加入100 mg/L氯霉素．斜面培養時培養基中不加入氯霉素．

發酵時選用PDA液體培養基：配制方法同上，不加入瓊脂和氯霉素，分裝至500 mL三角瓶中，每瓶100 mL，在121℃的溫度下滅菌20 min．

3)萃取液：乙酸乙酯－丙酮（體積比1∶1）．

4)紫杉醇標準樣：購自Sigma公司．

5)HPLC色譜儀：WatersTM600高效液相色譜儀，Waters 2487檢測器，Millenium32色譜管理系統（美國Waters公司生產）．

1．2 實驗方法

1．2．1 菌株分離方法

取三齡樹的中國南方紅豆杉的根、莖、葉片，先用自來水洗凈；將莖的樹皮剝下后切成1．0 cm×1．0 cm的小方塊，根和葉片則直接切成1．0 cm×1．0 cm的小方塊，用無菌水洗凈；然后浸入質量分數為75%的酒精中進行表面消毒，5 min后取出，再用無菌水反復洗凈后，置于裝有PDA固體培養基的平皿中央（每皿1塊）；將平皿置于溫度為28℃的培養箱中倒置培養3～4 d，待長出菌絲后，挑取不同菌絲末端接種到新的PDA培養基平皿上；再于28℃的溫度下培養3 d，連續接代純化(6～7次),即可得一純菌株．最后在PDA斜面培養基上于28℃的溫度下培養3 d，置于冰箱保存．

1．2．2 ZU07菌株的液體培養

在500 mL三角瓶中裝入100 mL液體培養基，滅菌、冷卻后在培養基中接入斜面菌絲，在28℃的溫度下用搖床培養7 d，搖床速度為200 r/min．

1．2．3 紫杉醇的提取與標準樣品的制備

1)紫杉醇的提取：將發酵液以5 000 r/min的轉速離心，取上清液于60℃的溫度下旋轉蒸發至1/10體積后，加入等體積的乙酸乙酯－丙酮（體積比1∶1）萃取2次，棄水相收集有機相；沉淀的菌體用組織搗碎儀處理后，經低溫凍溶2次，加入一定量的乙酸乙酯－丙酮（體積比1∶1）萃取液用超聲波細胞破碎儀處理15 min，然后以5 000 r/min的轉速離心；取上清液和前面的有機相液體混合于60℃旋轉蒸發至干，殘留物用5 mL的甲醇溶解，溶解液用5 000 r/min的轉速離心10 min，收集上清液過濾后保存備用．

2)標準樣品的制備：將5 mg紫杉醇標準品用甲醇溶解并定容至10 mL，過濾備用．

1．2．4 采用高效液相色譜技術檢測真菌培養物中紫杉醇的含量

HPLC條件：Xterra RP185 μm柱（Waters公司生產），柱的規格為3．9 mm×150 mm，等濃度洗脫；流動相：甲醇－乙腈－水（體積比為25∶35∶40），流速為1．4 mL/min；檢測波長為227 nm；進樣量為20 μL．

2 結果與分析

2．1 紅豆杉樹皮上微生物的類群及目的菌種的篩選

從南方紅豆杉三齡幼樹的根、莖、葉片中共分離得到23株內生真菌，分別以ZU01～ZU23編號標志（其中ZU表示肇慶學院，01～23表示序號），其中有1株（編號為ZU07，從主莖樹皮中分離得到）的孢子和菌絲的顯微結構與葛青平[10]所研究的紫杉醇產生菌——HU1353極為相似，因此選取ZU07作為主要研究對象．

2．2 菌株ZU07的形態觀察及分類定位

菌株ZU07在PDA培養基上于28℃的溫度下培養，開始為白色，第3天變為褐色，第5天可生長到6 cm；背部呈黑色，無滲出液；菌落呈褐色，平展、致密；邊緣整齊呈灰白色絨毛狀，見圖1．該菌株的菌絲和分生孢子梗具橫隔，菌絲多分枝，大小不一，見圖2．分生孢子單生或連成鏈狀，形狀為卵形和倒棍棒形，壁呈磚狀，光滑、具啄且有橫隔，見圖3～4．這些特征與半知菌亞門（Deuteromycotina）,絲孢綱（Hyphomycetes）、暗色孢科（Dematiaceae）、鏈格孢屬[11]（Alternaria spp）的分類特征相吻合．此外，因與葛菁萍等[10]從東北紅豆杉中分離到的一新種紅豆杉鏈格孢完全相同，故定位為紅豆杉鏈格孢（Alternaria taxi）．

圖1 ZU07菌落形態（培養7 d）

圖2 ZU07菌絲形態及孢子著生形態（400倍）

圖 3 ZU07孢子形態（400倍）

圖4 ZU07孢子及其孢子喙（400倍）

2．3 高效液相色譜測定

采用高效液相色譜系統對ZU07發酵液提取物進行定性與定量檢測，結果如圖5所示．

圖 5 紫杉醇標準品和ZU07菌株HPLC圖譜

由圖5可見，ZU07發酵液提取物中含有與紫杉醇標準品UV圖譜、Rt值較為接近的色譜峰，標準品Rt值為3．702,而ZU07發酵液提取物為3．700，兩者接近，表明ZU07發酵液提取物中含有紫杉醇類化合物的成分．根據峰的積分面積計算得出樣品中紫杉醇的含量，再根據發酵液總量可計算出ZU07菌株液體培養物中紫杉醇的質量濃度約為214．45 μg/L，此為目前國內從紅豆杉屬樹皮中分離出能產紫杉醇的菌株中產量較高的野生菌株，值得進一步深入研究．

[1] 俞天驥.紫杉醇-抗腫瘤新藥[J].國外醫學:藥學分冊,1993,20:72.

[2] STIERLE A,STROBEL G.Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae,an endophytic fungus of pacific yew[J].Science，1993,260(5105):214-216.

[3] 邱德有,黃美娟,方曉華,等.一種云南紅豆杉內生真菌的分離[J].真菌學報,1994,13(4):314-316.

[4] STROBEL G,YANG Xisi,SEARS J.Taxol from Pestalotiopsis microspora,an endophytic fungus of Taxus wallachiana[J].Microbiology,1996,142:435-440.

[5] 王建峰,呂華鷹,黃耀堅,等.一株新的紫杉醇產生菌及其抗腫瘤活性[J].廈門大學學報:自然科學版,1999,38(4):485-487.

[6] 周東波,平文祥,孫劍秋,等.紫杉醇產生菌分離的研究[J].微生物學雜志,2001,21(1):18-19.

[7] 胡凱,談鋒,唐克軒,等.南方紅豆杉中產紫杉醇內生真菌的分離和篩選[J].西南師范大學學報:自然科學版,2006,31(1):134-137.

[8] 何穎,談鋒,謝建平.紅豆杉內生真菌產紫杉醇研究進展[J].天然產物研究與開發,2006,18:519-523.

[9] 馬玉超,趙凱,王世偉,等.產紫杉醇（Taxol）內生真菌的生物多樣性[J].菌物研究,2003,1(1):28-32.

[10] 葛箐平,平文祥,馬璽,等.紫杉醇產生菌HU1353的鑒定[J].微生物學雜志,2004,24(3):19-21.

[11] 張天宇.鏈格孢屬[M]//中國真菌志:第16卷.北京:科學出版社,2003:233.

Isolation and Identification of Endophytic Fungus Associated Containing Taxol

LIANG Shengnian

(College of Life Sciences,Zhaoqing University,Zhaoqing,Guangdong 526061,China)

A strain of endophytic fungus which remark ZU07 was isolated from the inner bark of threeyear-old Taxus chinensis var.mairei,by HPLC of the culture fluid from the fermentation of fungus,the results showed that ZU07 could synthesize anti-cancer drugs of Taxol,its content was about 214.45 μg/L.

Taxus chinensis var.mairei;Taxol;endophytic Fungus;HPLC

S459

A

1009－8445（2011）02－0061－03

(責任編輯：陳 靜)

2009－06－15

梁盛年（1973－）,男,廣東肇慶人,肇慶學院生命科學學院實驗師．