白毛藤全草水提取物誘導(dǎo)人胃癌BGC-823細胞凋亡作用及其機制研究△

楊旭東，張杰，徐曉宇

(1.黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.黑龍江省黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150076)

藥 理

白毛藤全草水提取物誘導(dǎo)人胃癌BGC-823細胞凋亡作用及其機制研究△

楊旭東1*，張杰1，徐曉宇2

(1.黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.黑龍江省黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150076)

目的：探討survivin、bax基因在白毛藤誘導(dǎo)人胃癌細胞凋亡中的作用。方法：不同濃度白毛藤作用于BGC-823細胞48 h后，熒光顯微鏡觀察BGC-823細胞凋亡情況，RT-PCR法檢測survivin、bax基因表達量的變化。結(jié)果：白毛藤能誘導(dǎo)BGC-823細胞凋亡，并且上調(diào)bax和降低survivin表達。結(jié)論：白毛藤能促進BGC-823細胞凋亡，其機制可能與激活bax、抑制survivin表達有關(guān)。

白毛藤；胃癌；細胞凋亡

白毛藤SolanumlyratumThunb.系茄科植物白英的全草，具有清熱利濕、消腫解毒的功效[1]。有研究表明，其水提物有較強的腫瘤細胞增殖抑制活性[2-4]，但對其抗癌作用機理闡述并不明確。本研究擬觀察白毛藤對人胃癌細胞BGC-823細胞是否具有誘導(dǎo)凋亡作用，并初步探討其作用機制，為白毛藤應(yīng)用于胃癌的臨床治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株

人胃癌細胞BGC-823細胞株(武漢中美科技有限公司)。

1.2 藥物、試劑與儀器

白毛藤全草購自牡丹江保健大藥房，經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與藥物研究中心袁曉環(huán)教授鑒定為S.lyratum的全草。MTT試劑(泰倫生物科技有限公司，批號：041025)；Trizol，(Sigma公司，批號：15596-018)；引物核苷酸片段(上海生工生物技術(shù)有限公司)。奧林巴斯CKX41-F32FL熒光顯微鏡。

1.3 藥物處理

白毛藤全草干品20 g，粉碎，用400 mL雙蒸水浸泡30 min，加熱沸騰60 min，倒出液體留用，藥渣加200 mL雙蒸水再煮1次，合并兩次煮出液，使其自然冷卻，100目篩絹過濾，棄藥渣。濾液經(jīng)15 000 r·min-1、4 ℃離心20 min，上清液用冷凍干燥機冷凍干燥，將干燥物溶解于40 mL PBS，0.22 μm除菌濾器過濾除菌，得0.5 g·mL-1的棕褐色澄清透明溶液，避光冷藏，實驗時再稀釋為所需要的藥物終濃度。

2 方法

2.1 實驗分組

實驗組：RPMI-1640培養(yǎng)液倍比稀釋的4，8，16 mg·mL-1的白毛藤水提液。對照組：含BGC-823細胞的RPMI-1640培養(yǎng)液。

2.2 MTT比色法測定細胞增殖抑制率

收集對數(shù)生長期腫瘤細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個·mL-1，每孔100 μL接種于96孔板中。每個劑量設(shè)12個平行孔，分別培養(yǎng)12,24,48 h后，加入5 g·L-1MTT 20 μL(調(diào)零組除外)繼續(xù)培養(yǎng)；4 h后，吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO溶解樣品，采用酶標儀測定各孔490 nm吸光度(OD)值。比色時以RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)零。按公式計算細胞生長抑制率(inhibition rate，IR)。IR=(對照組OD-實驗組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100 %。

2.3 細胞凋亡檢測

取指數(shù)生長期的癌細胞，加入適量0.25 %胰蛋白酶液消化細胞，使貼壁細胞脫落。用含10 %胎牛血清的培養(yǎng)基制備成濃度為3×105個·mL-1的細胞懸液，于6孔板中每孔接種1 mL。將普通潔凈蓋玻片置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱。24 h后加入不同質(zhì)量濃度的白毛藤；對照組加相同體積的培養(yǎng)液。48 h后細胞用胰酶消化，冷PBS(pH 7.2)洗3遍，固定液甲醇-冰醋酸(3∶1)，4 ℃固定10 min，棄固定液，蒸餾水洗3遍，室溫干燥，用5 mg·L-1Hoechst 33258染色，37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中孵育15 min，將孔中的蓋玻片取出，蓋在已滴好甘油的載玻片上，置于熒光倒置顯微鏡上觀察細胞形態(tài)并拍照。隨機選取10個視野拍照后計數(shù)其凋亡細胞與正常細胞，凋亡率=[凋亡細胞/(凋亡細胞+正常細胞)]×100 %。

2.4 細胞凋亡檢測

取腫瘤細胞總RNA，用RT-PCR方法檢測腫瘤細胞survivin、bax基因表達。設(shè)計引物如下：survivin引物，上游：5′-TTGGCAGGTGCCTGTTGAAT-3′；下游：5′-AGCCAGTCCCCCACAGCAT-3′，擴增片段329 bp。bax引物，上游：5′-GTTTCATCCAGGATCGAGC-3′；下游：5′-GGAAGTCCAATGTCCAGC-3′，擴增片段345 bp。β-actin引物，上游：5′-ATGTGGCACCACACCTTCTA-3′，下游：5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3′，擴增片段838 bp。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃45 s，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃復(fù)性5 min。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，分別計算survivin、bax與內(nèi)參擴增帶熒光強度×面積的比值，得出survivin、bax mRNA的相對表達量。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，通過survivin/β-actin和bax/β-actin的灰度比值作相對定量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 各組胃癌BGC-823細胞增殖對比

不同濃度白毛藤隨著作用時間延長，對細胞增殖反應(yīng)抑制作用明顯增強(P<0.01)；隨著濃度增加，對細胞增殖抑制作用明顯增強，各劑量組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，白毛藤抑制胃癌細胞的增殖，呈濃度和時間依賴性,見表1。

3.2 熒光顯微鏡檢測細胞凋亡情況

熒光顯微鏡觀察不同濃度白毛藤作用48 h后，可見藍色深染的凋亡細胞，并可見細胞核碎裂，細胞體積縮小。實驗組與對照組比較有顯著性差異，見圖1、2。

表1 各組胃癌BGC-823細胞增殖對比

注：與4 mg·mL-1白毛藤組對比，**P<0.01

圖1 對照組熒光顯微鏡細胞圖

圖2 16 mg·mL-1白毛藤水提液熒光顯微鏡細胞

3.3 各組survivin和bax基因表達情況

與對照組相比，不同濃度白毛藤水提液作用48 h后，腫瘤細胞中survivin基因表達逐漸降低，bax基因表達逐漸增加，16 mg·mL-1組最明顯，見表2。

表2 各組bax和survivin表達情況

注：與對照組比較，**P<0.01，*P<0.05

4 討論

胃癌是常見的消化道腫瘤之一，化學(xué)治療在胃癌治療中占有很重要的地位，但存在較嚴重的不良反應(yīng)和耐藥性。目前中藥因其不僅對腫瘤具有抑制作用，且不易產(chǎn)生耐藥性，對機體的損傷和副作用也較小，已經(jīng)成為治療腫瘤的重要手段。因此，從傳統(tǒng)中藥中尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物已成為抗腫瘤藥物研究及新藥開發(fā)的重要組成部分。白毛藤作為抗癌中藥之一，已證明有較強的腫瘤細胞增殖抑制活性，但對其抗癌作用機理闡述并不明確。

細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡(Programed cell death，PCD)，是在精密調(diào)節(jié)下的細胞主動死亡過程，在個體發(fā)育生長過程中起重要作用。細胞凋亡的異常與多種病理生理過程相關(guān)，如腫瘤的發(fā)生發(fā)展、動脈粥樣硬化、自身免疫疾病等。bcl基因家族是重要的凋亡調(diào)控基因，包括抑凋亡基因bcl-2、bcl-xl和促凋亡基因如bax、bak、bcl-xs等。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)[5-6]，bax在多種腫瘤的細胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮重要作用。白毛藤水提液可以明顯上調(diào)胃癌BGC-823細胞bax基因表達，隨著藥物濃度的增加，腫瘤細胞中bax基因表達逐步上調(diào)，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。survivin作為凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的成員，對細胞凋亡和細胞周期的基因調(diào)控具有重要的作用。大部分腫瘤細胞中均有表達[7-8]，是迄今發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子。本研究結(jié)果證實，白毛藤水提液可以明顯下調(diào)胃癌BGC-823細胞survivin基因表達，隨著白毛藤水提液藥物濃度的增加，腫瘤細胞中survivin基因表達逐步下調(diào)，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

[1] 馮洪錢.民間獸醫(yī)本草[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻出版社，1993：307-308.

[2] 蘭菲菲.白毛藤提取物對肝癌SMMC-7721細胞增殖及c-myc基因表達的抑制[J].廣東醫(yī)學(xué)，2006，27(12)：1779-1782.

[3] 楊旭東，張杰，楊驕霞.白毛藤對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響[J].中國現(xiàn)代中藥，2010，12(4)：34-36.

[4] 崔建國，陳小軍，孫志良，等.白毛藤生物堿的提取及體外抗菌活性研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2004，7(5)：41-42.

[5] 劉學(xué)軍，杜娟.槐耳清膏對荷瘤小鼠瘤細胞Bcl-2、Bax表達的影響[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，29(2)：60-62.

[6] 耿明，曹永成，邰艷紅，等.胃黏膜癌前病變和胃癌組織相關(guān)癌基因和抑癌基因表達差異的研究[J].中華腫瘤防治雜志，2008，15(16)：1212-1214.

[7] Carlsson G,Boxhammer S,Garwicz D,et al. Survivin expression in the bone marrow of patients with severe congenital neutropenia[J]. Leukemia,2009, 23(3): 622-625.

[8] Wu YK, Chen KT, Kuo YB, et al. Quantitative detection of survivin in malignant pleural effusion for the diagnosis and prognosis of lung cancer[J]. Cancer Lett, 2009, 273(2): 331-335.

StudyofWaterExtractofWholeHerbofSolanumLyratumonInducingApoptosisofHumanGastricCancerBGC-823CellsandItsEffectiveMechanism

YANG Xu-dong1，ZHUANG jie1，XU Xiao-yu2

(1.MudanjiangMedicalCollege，Mudanjiang157011，China；2.SecondClinicalMedicalCollegeofHarbinMedicalUniversity，Harbin150076，China)

Objective: To investigate the effect of the bax and survivin gene in whole herb ofSolanumlyratumThunb.inducing apoptosis of human gastric cancer lines BGC-823 cell.Methods: BGC-823 cells were treated with water extract of whole herb ofS.lyratumat different concentrations， After 48h, the apoptosis of BGC-823 cell was observed by fluorescence microscope，and the levels of bax and survivin gene expression were detected by RT-PCR method.Results: The water extract of whole herb ofS.lyratumhas obviously apoptosis-inducing effects on BGC-823 cells and could effectively decrease the level of survivin gene expression and increase the level of bax gene expression.Conclusion: The water extract of whole herb ofS.lyratumcould induce apoptosis of BGC-823 cells probably through down regulating bax gene expression and u Pregulating survivin gene expression.

SolanumlyratumThunb.; Gastric cancer lines BGC-823 cell; Apoptosis

黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題——白毛藤抗腫瘤單體篩選及其對腫瘤細胞基因表達的影響(2007-003)

*楊旭東，Email：xingzhe01mdj@126.com

2010-11-12)