酸性染料比色法測定白芥子中總生物堿的含量

呂偉，田實民

(棗莊市藥品檢驗所，山東 棗莊 277102)

酸性染料比色法測定白芥子中總生物堿的含量

呂偉*，田實民

(棗莊市藥品檢驗所，山東 棗莊 277102)

目的：建立白芥子中總生物堿含量測定的方法。方法：采用酸性染料比色法測定白芥子中總生物堿含量。結果：酸性染料比色法顯色的條件為pH 4.2的緩沖液10 mL，0.04 %的溴甲酚綠溶液2.0 mL，三氯甲烷萃取4次，每次5 mL，檢測波長332 nm。芥子堿硫氰酸鹽在1.696～16.960 μg·mL-1與吸光度呈良好的線性關系，平均回收率99.75 %，RSD=1.16 %(n=6)。結論：該方法靈敏度高，準確性，重現性好。

酸性染料比色法；白芥子；總生物堿；含量測定

白芥子為十字花科植物白芥SinapisalbaL.的干燥成熟種子，具有溫肺豁痰利氣、散結通絡止痛的功能[1]。化學成分與藥理研究表明，以芥子堿為代表的生物堿類成分是其有效部位之一[2-4]，《中國藥典》采用HPLC對芥子堿含量進行控制[1]。本文首次采用酸性染料比色法，以主要有效成分芥子堿硫氰酸鹽為對照品，建立白芥子中總生物堿的含量測定方法，為進一步全面控制白芥子藥材質量提供實驗依據。

1 儀器與試藥

UV-2401PC紫外-可見分光光度計(日本島津)，超聲波藥品處理機(濟寧金百特電子有限公司)。芥子堿硫氰酸鹽對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號111702-200501)。所用試劑均為分析純。白芥子樣品，購自不同產地，經山東中醫藥大學石俊英教授鑒定為十字花科植物白芥SinapisalbaL.的種子。

2 方法與結果

2.1 對照品貯備液制備

精密稱取芥子堿硫氰酸鹽對照品10.6 mg，用pH 4.2的醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解并定容至25 mL，作為芥子堿硫氰酸鹽對照品貯備液(濃度424 μg·mL-1)。

2.2 對照品溶液制備

精密量取芥子堿硫氰酸鹽對照品貯備液0.5，1，2，3，5 mL，用pH 4.2的醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋至10 mL，配成5個濃度的芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取樣品粉末0.5 g，精密稱定，精密加入pH 4.2的醋酸-醋酸鈉緩沖液100 mL，超聲處理30 min，用pH 4.2的醋酸-醋酸鈉緩沖液補足損失的重量，濾過，精密量取續濾液2 mL，置分液漏斗中，加入pH 4.2的醋酸-醋酸鈉緩沖液10 mL，0.04 %的溴甲酚綠溶液2.0 mL，用三氯甲烷萃取4次(5，5，5，5 mL)，合并三氯甲烷萃取液，用三氯甲烷定容至25 mL。

2.4 標準曲線制備

精密量取芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液2 mL，置分液漏斗中，加入pH 4.2的醋酸-醋酸鈉緩沖液10 mL，0.04 %的溴甲酚綠溶液2.0 mL，用三氯甲烷萃取4次(5，5，5，5 mL)，合并三氯甲烷萃取液，用三氯甲烷定容至25 mL，以相應試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在332 nm處測定吸光度值。以吸光度A為縱坐標，芥子堿硫氰酸鹽濃度C為橫坐標，計算標準曲線，得回歸方程A=4.987 0×10-2C+7.551 5×10-2，r=0.999 8。表明芥子堿硫氰酸鹽對照品濃度在1.696～16.960 μg·mL-1與所形成的酸性染料離子對的吸光度之間呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

精密量取芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液(濃度42.4 μg·mL-1)2 mL，按標準曲線繪制方法操作，在332 nm處連續6次測定吸光度，計算RSD=0.08 %，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0，20，40，60，80，100，120 min在332 nm處測定吸光度，計算RSD=0.15 %，表明供試品溶液在制備后120 min內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

取5號樣品粉末0.5 g，6份，按樣品測定方法平行測定，計算總生物堿含量，RSD=0.19 %。表明方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取5號樣品(已知總生物堿含量1.487 %)粉末0.5 g，6份，精密稱定，精密加入芥子堿硫氰酸鹽對照品6.96 mg，按樣品測定方法操作，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 總生物堿加樣回收率試驗

注：芥子堿硫氰酸鹽對照品加入量均為6.96mg

2.9 樣品中總生物堿含量測定

取不同產地樣品粉末0.5 g，按2.3制備供試品溶液，以相應試劑為空白。照紫外-可見分光光度法，在332 nm處測定吸光度值，由標準曲線讀出濃度C，以干燥品計算總生物堿含量，結果見表2。

表2 不同產地白芥子總生物堿含量測定 /%

注：n=3

3 討論與小結

現有的總生物堿的含量測定方法主要有重量法、酸堿滴定法和酸性染料比色法。其中重量法和酸堿滴定法專屬性差，靈敏度低，所需樣品量大。酸性染料比色法測定中藥中總生物堿的含量，是根據一定pH值條件下，生物堿鹽的陽離子和酸性染料的陰離子定量結合生成有色的絡合物(即離子對)，此離子對可以定量地被某種有機溶劑萃取的原理，通過測定萃取液的吸光度，來測定中藥中總生物堿含量的方法[5]。

本文對酸性染料的種類(甲基橙、溴甲酚綠、溴酚藍、溴麝香草酚藍)、酸性染料的用量、檢測波長、水相pH值、緩沖液的用量、試劑加入順序、萃取條件、樣品處理方法等多個實驗條件進行了優化篩選。實驗結果表明，芥子堿硫氰酸鹽對照品與甲基橙形成的絡合物在200～500 nm無特征吸收；與溴酚藍、溴麝香草酚藍形成的絡合物及空白溶液在332、415 nm處吸收均較大；與溴甲酚綠形成的絡合物在332、415 nm處吸收較大而空白溶液在332 nm吸收很小，故選擇溴甲酚綠為顯色的酸性染料；確定檢測波長為332 nm。pH 4.0～4.4，芥子堿硫氰酸鹽對照品與溴甲酚綠形成的絡合物有比較穩定的最大吸光度值，故選擇pH 4.2為顯色的pH值。溴甲酚綠溶液用量在1.5～2.5 mL，芥子堿硫氰酸鹽對照品與其形成的絡合物有比較穩定的最大吸光度值，故選擇2.0 mL為酸性染料的用量。緩沖液用量在8～12 mL，芥子堿硫氰酸鹽對照品與溴甲酚綠形成的絡合物有比較穩定的最大吸光度值，故選擇緩沖液的用量為10 mL。以緩沖液-染料-三氯甲烷的順序加入試劑操作，芥子堿硫氰酸鹽對照品與溴甲酚綠形成的絡合物有最大的吸光度值，故確定試劑加入順序為緩沖液-染料-三氯甲烷。經過3次萃取，三氯甲烷已經能將生物堿酸性染料離子對提取99.9 %以上，為確保提取的充分與完全，確定萃取條件為三氯甲烷萃取4次(5,5,5,5 mL)。樣品超聲提取30 min或回流提取2 h以后，延長提取時間，測得總生物堿含量均不再增加；超聲提取30 min與回流提取2 h的提取效果相當；超聲提取更簡便、省時，故確定樣品的提取方法為超聲提取30 min。最終確定最佳實驗條件為：溴甲酚綠為顯色的酸性染料，用量2.0 mL，檢測波長332 nm，顯色水相pH 4.2，緩沖液用量10 mL，試劑加入順序為緩沖液-染料-三氯甲烷，萃取條件為三氯甲烷萃取4次(5,5,5,5 mL)，樣品提取方法為超聲提取30 min。該方法操作簡便、快捷、準確、穩定性好、靈敏度高、重現性好、加樣回收率高、人為誤差小，可以用作白芥子的質量控制。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：149-150.

[2] 南京中醫藥大學.中藥大辭典[M].上冊.上海：上海科學技術出版社，2006：983.

[3] 李晶，石卓，趙麗娟，等.芥子堿硫酸氫鹽對自發性高血壓大鼠血壓和心率的影響[J].吉林中醫藥，2002，22(6)：55-56.

[4] 張明發，沈雅琴.芥子堿的抗炎和抗腹瀉作用[J].中藥藥理與臨床，1996，12(1)：29-31.

[5] 蔣愛芳，楊義芳，黃文武.酸性染料比色法測定總生物堿的研究進展[J].中草藥，2006，37(增刊)：359-362.

DeterminationoftheTotalAlkaloidsinSemenSinapisAlbabyAcidDyeColorimetry

Lü Wei，TIAN Shi-min

(1.ZaozhuangInstituteofDrugControl，Zaozhuang277102，China)

Objective:To investigate the method of determination of total alkaloids in SemenSinapisalba.Methods：The Contents of total alkaloids were determined by Acid dye colorimetry.Results：Acid dye color conditions：pH 4.2 buffer 10 mL，0.04 % bromocresol green liquid 2.0 mL，chloroform extraction four times，each time use 5 mL，and the wavelength was at 332 nm.The linear range of Sinapine thiocyanate was 1.696～16.960 μg·mL-1，the mean recovery was 99.75 %，RSD=1.16 % (n=6).Conclusion：This method is simple，sensitive and accurate with good reproducibility.

Acid Dye Colorimetry; SemenSinapisalba; Total Alkaloids; Determination

*呂偉，E-mail：lvwei0632@126.com

2011-01-07)