利用細(xì)莖石斛種子胚繁育試管苗的不同培養(yǎng)基研究△

張倩倩，劉守金，俞年軍，方成武

(安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 安徽省現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031)

栽 培

利用細(xì)莖石斛種子胚繁育試管苗的不同培養(yǎng)基研究△

張倩倩，劉守金*，俞年軍，方成武

(安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 安徽省現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031)

目的：建立細(xì)莖石斛Dendrobiummoniliforme(L.)Sw.種子胚的組織培養(yǎng)和快速繁殖方法。方法：在相同的培養(yǎng)條件下，種子胚接種于8種不同培養(yǎng)基上，選擇長(zhǎng)勢(shì)相近的試管苗轉(zhuǎn)接于添加不同濃度激素的1/2 MS培養(yǎng)基上，對(duì)不同生長(zhǎng)狀況的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。結(jié)果：比較適合誘導(dǎo)細(xì)莖石斛種子萌發(fā)的培養(yǎng)基是1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA，生根的培養(yǎng)基是1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA，壯苗的培養(yǎng)基1/2 MS+1.2 mg·L-1IBA。結(jié)論：適合的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)莖石斛種子胚的生長(zhǎng)發(fā)育結(jié)果有很大差異。

細(xì)莖石斛；組織培養(yǎng)；種子胚

細(xì)莖石斛Dendrobiummoniliforme(L .)Sw.又名銅皮石斛，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，以莖入藥，性寒，味甘，具有滋陰清熱、益胃生津、消炎止痛、增強(qiáng)免疫力等功效，歷來(lái)作為石斛品種來(lái)源之一。石斛屬植物主要分布于我國(guó)西南地區(qū)，大別山區(qū)是該屬植物的分布北緣，也是藥用優(yōu)質(zhì)石斛的主要分布區(qū)域，細(xì)莖石斛是安徽大別山區(qū)野生變家種的品種之一。由于該種的生長(zhǎng)與繁殖對(duì)環(huán)境要求嚴(yán)格，種子缺乏胚乳組織，僅有幾個(gè)細(xì)胞的不成熟胚，自然條件下萌發(fā)率極低[1]，加上環(huán)境的破壞和人們對(duì)野生資源的掠奪性采挖，導(dǎo)致資源的嚴(yán)重匱乏。目前石斛的低繁殖率是制約規(guī)模化生產(chǎn)的關(guān)鍵問(wèn)題。該屬植物通過(guò)組織培養(yǎng)進(jìn)行繁殖有許多研究[2]，細(xì)莖石斛以莖段為外植體、種子通過(guò)組織培養(yǎng)進(jìn)行繁殖研究較少[3-5]。本試驗(yàn)在已有的研究基礎(chǔ)上，對(duì)安徽霍山產(chǎn)的細(xì)莖石斛種子胚萌發(fā)及生根壯苗的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)基篩選研究，優(yōu)化培養(yǎng)條件，為細(xì)葉石斛的規(guī)模化生產(chǎn)提供組培苗方面的研究試驗(yàn)探索。

1 材料

細(xì)莖石斛的果實(shí)于2009年12月采自安徽霍山縣太平畈鄉(xiāng)，原植物經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院劉守金教授鑒定為蘭科植物細(xì)莖石斛Dendrobiummoniliforme(L .)Sw.，憑證標(biāo)本ZH001存于安徽中醫(yī)學(xué)院標(biāo)本館(ACM)。

2 方法

2.1 種子胚萌發(fā)培養(yǎng)

將細(xì)莖石斛的果實(shí)沖洗干凈，置0.1 %升汞試液中表面消毒8 min，無(wú)菌水沖洗3次，再用75 %乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗3次；用無(wú)菌鑷子撕開(kāi)果皮，輕輕抖動(dòng)，把種子散落到加入無(wú)菌水的小燒杯中，使種子呈懸浮狀態(tài)；用吸管吸取懸浮液，分別接種在1/2 MS、1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA、MS、MS+1.0 mg·L-1NAA、KC、KC+1 mg·L-1NAA、B5、B5+1.0 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基各10瓶，觀察100 d記錄。

2.2 生根壯苗培養(yǎng)

從細(xì)莖石斛種子胚培養(yǎng)出的幼苗中，選取高度、長(zhǎng)勢(shì)相近，沒(méi)有生根的幼苗轉(zhuǎn)接到1/2 MS培養(yǎng)基中，分別加激素NAA濃度為0.5，1.0，1.5，2.0 mg·L-1；激素IBA濃度為0.1，0.4，0.8，1.2 mg·L-1的培養(yǎng)基上，每種10瓶，每瓶接種6個(gè)小苗，觀察90 d記錄。

2.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度25 ℃，前5 d為暗培養(yǎng)，后期光照強(qiáng)度2 500 lx，光照時(shí)間10 h·d-1，濕度75 %。

2.4 觀察記錄項(xiàng)目

觀察種子萌發(fā)情況和在不同培養(yǎng)基上試管苗的長(zhǎng)勢(shì)情況，包括轉(zhuǎn)綠時(shí)間、原球莖形成時(shí)間、形態(tài)分化時(shí)間、形成叢生芽的形態(tài)、平均苗高、苗壯度、葉色、葉長(zhǎng)；平均根長(zhǎng)、根數(shù)、根長(zhǎng)勢(shì)、平均株高、叢生苗數(shù)、葉長(zhǎng)/寬、葉色、健壯度。

3 結(jié)果

3.1 不同培養(yǎng)基配方對(duì)細(xì)莖石斛種子胚的萌發(fā)和原球莖分化的影響

組織培養(yǎng)18 d后，1/2 MS+NAA培養(yǎng)基中種子胚最先轉(zhuǎn)綠，1/2 MS、MS、MS+NAA、KC、KC+NAA、B5+NAA培養(yǎng)基中種子胚陸續(xù)轉(zhuǎn)綠，并逐漸膨大，B5培養(yǎng)基中種子未見(jiàn)萌發(fā)轉(zhuǎn)綠，見(jiàn)表1。

35 d后，1/2 MS+NAA培養(yǎng)基中形成原球莖，單個(gè)原球莖呈小圓錐狀，或多個(gè)呈桑椹狀，單個(gè)原球莖直徑達(dá)到0.6～0.8 cm。原球莖頂端有鱗片狀的葉原基突起，呈深綠色；MS、MS+NAA培養(yǎng)基中原球莖較小，直徑最大達(dá)到0.4 cm，呈淡黃綠色。KC+NAA、KC培養(yǎng)基中原球莖直徑最大達(dá)到0.5 cm，呈翠綠色。B5+NAA培養(yǎng)基中原球莖小，直徑僅有0.2 cm。B5培養(yǎng)基中未形成原球莖，見(jiàn)表1。

45 d后，1/2 MS+NAA培養(yǎng)基中原球莖大量分化，形成莖、芽，均粗壯，葉片多，顏色深，葉最長(zhǎng)約1.0 cm，苗最高達(dá)到1.2 cm，長(zhǎng)勢(shì)很好。KC和KC+NAA培養(yǎng)基中，苗大量叢生，成簇狀，但苗比1/2 MS和1/2 MS+NAA細(xì)小。MS、KC培養(yǎng)基中原球莖沒(méi)有分化，見(jiàn)表2。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)細(xì)莖石斛原球莖形成的影響

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)細(xì)莖石斛幼苗發(fā)育的影響

注：+-不發(fā)達(dá)；++ - 一般發(fā)達(dá)；+++ -較發(fā)達(dá)；++++ -最發(fā)達(dá)

3.2 不同濃度的IBA激素對(duì)細(xì)莖石斛壯苗的影響

觀察1/2 MS培養(yǎng)基中，加濃度分別為0.1，0.4，0.8，1.2 mg·L-1的激素IBA，平均株高、葉片長(zhǎng)度/寬度逐漸增加，葉片顏色逐漸變深，苗逐漸粗壯。平均根長(zhǎng)逐漸增長(zhǎng)、根數(shù)增多，根由細(xì)、小長(zhǎng)為粗、長(zhǎng)。當(dāng)IBA激素濃度達(dá)到1.2 mg·L-1時(shí)，苗最健壯，見(jiàn)表3。

表3 不同濃度的IBA激素對(duì)細(xì)莖石斛壯苗的影響

注：+-不發(fā)達(dá)；++ - 一般發(fā)達(dá)；+++ -較發(fā)達(dá)；++++ -最發(fā)達(dá)

3.3 不同濃度的NAA激素對(duì)細(xì)莖石斛生根的影響

在1/2 MS培養(yǎng)基中添加不同濃度NAA組中，濃度為0.5 mg·L-1和1.5 mg·L-1的兩組植株均白化死亡。由表4觀察出，濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，生根率達(dá)到了100 %，根長(zhǎng)、粗、壯，并且叢生苗多，葉大、色深，苗長(zhǎng)勢(shì)健壯。濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，平均根長(zhǎng)達(dá)到了1.2 cm，生根率為80 %，根粗、壯。叢生苗達(dá)到3個(gè)，葉大，但有很多黃葉。

表4 不同濃度的NAA激素對(duì)細(xì)莖石斛生根的影響

注：++ -一般發(fā)達(dá)；+++ -較發(fā)達(dá)

4 結(jié)論與討論

通過(guò)8種不同培養(yǎng)基對(duì)細(xì)莖石斛種子萌發(fā)和分化影響的比較研究，結(jié)果表明,在1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA培養(yǎng)基，種子胚培養(yǎng)約18 d種子開(kāi)始變綠，并逐漸膨大；培養(yǎng)35 d后觀察，由種子形成的原球莖比較均勻，直徑在0.6～0.8 cm。其后原球莖上端開(kāi)始有芽形成，45 d后觀察幼苗形成。1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA培養(yǎng)基對(duì)細(xì)莖石斛的原球莖形成、分化時(shí)間最短，幼苗平均高達(dá)到了1.2 cm，莖粗、壯，葉最長(zhǎng)1 cm，葉片多，顏色深，長(zhǎng)勢(shì)最好。在KC+NAA培養(yǎng)基組中，種子胚通過(guò)培養(yǎng)產(chǎn)生大量簇生的幼苗，但苗較1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA培養(yǎng)基萌發(fā)的苗細(xì)小。試驗(yàn)結(jié)果提示在同類培養(yǎng)基中，添加NAA激素組的種子萌發(fā)情況均好于不添加激素組。MS、B5和B5+NAA培養(yǎng)基均不適合細(xì)莖石斛的種子萌發(fā)。

在比較1/2 MS培養(yǎng)基中添加不同濃度IBA對(duì)生根的影響中，當(dāng)激素IBA濃度為1.2 mg·L-1時(shí)，苗的長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較好，生根率達(dá)到80 %，平均根數(shù)及平均根長(zhǎng)均最好，1/2 MS +1.2 mg·L-1IBA是壯苗和生根的最適培養(yǎng)基。

[1] 張明，夏鴻西，朱利泉，等.石斛組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2000，25，(6)：323-326.

[2] 明興加，馮婷婷.中國(guó)石斛屬植物種苗繁育技術(shù)的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010,38(6)：2899-2902，2920.

[3] Choi SK, Lee DK. The study on the artificial propagation ofDendrogiummoniliformein wild medicinal herb[J]. The Research Reports of the Rural Development Administration,1989, 31(3): 52-56.

[4] 王再花,涂紅艷,葉慶生.細(xì)莖石斛的快速繁殖和試管開(kāi)花誘導(dǎo)[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(6)：1143-1144.

[5] 田雪琪,張鐵.細(xì)莖石斛組織培養(yǎng)研究[J].文山師范高等專科學(xué)校學(xué)報(bào),2007,20(3)：114-116.

TissueCulturingandRapidPropagationofDendrobiummoniliforme(L.)Sw.

ZHANG Qian-qian, LIU Shou-jin, YU Nian-jun, FANG Cheng-wu

(SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,AnhuiKeyLaboratoryofModernTraditionalChineseMedicine,Hefei, 230031,China)

Objective:To established the optimal medium and culture condition for in vitro culture and rapid propagation of embryo ofD.moniliforme.Methods: The embryo was inoculated and cultivated in 8 different kinds of culture medias under the same culture condition.The same length of seeding was inoculated in 1/2 MS solid medium with different concentrations of hormones (NNA and IBA).Results:1/2 MS containing 1.0 mg·L-1NAA is the best media for embryo germination,and 1/2 MS containing 1.0 mg·L-1NAA is the best media for the developing of roots;and 1/2 MS containing 1.2 mg·L-1IBA is the best media for plantlet strengthening.Conclusion: Tissue culture is effective way in the rapid propagation for large-scale production ofD.moniliforme.

Dendrobiummoniliforme; Tissue culture; Embryo.

安徽省自然基金項(xiàng)目(090413110)，安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2010A203)

*劉守金，Tel：(0551)5169306,E-mail：liushjin@hotmail.com

2010-12-09)