N，N′-二環己基-N-二十二碳酸酰脲解離常數測定△

劉全軍,鄺曉聰,王聞楚,莫德歡,秦箐*

(1.廣西醫科大學藥學院天然藥物化學教研室，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室，廣西 南寧 530021)

化 學

N，N′-二環己基-N-二十二碳酸酰脲解離常數測定△

劉全軍1,鄺曉聰2,王聞楚1,莫德歡1,秦箐1*

(1.廣西醫科大學藥學院天然藥物化學教研室，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室，廣西 南寧 530021)

目的：測定N，N′-二環己基-N-二十二碳酸酰脲解離常數。方法：采用紫外分光光度法及A-pH曲線法測定N，N′-二環己基-N-二十二碳酸酰脲解離常數。結果：紫外分光光度法測得N，N′-二環己基-N-二十二碳酸酰脲的pKa為7.16±0.24，A-pH曲線法求得pKa為6.98。

N，N′-二環己基-N-二十二碳酸酰脲；解離常數；紫外分光光度法；A-pH曲線法

N，N′-二環己基-N-二十二碳酸酰脲(DCHDU)為從板藍根中發現的板藍根高級不飽和脂肪酸為先導化合物合成的新化合物，完成了抗腫瘤及免疫調節定量構效關系(QSAR)的研究，從中篩選出的一個新化合物，經免疫調節[1-3]及抗腫瘤[4]作用機制的研究顯示，化合物DCHDU在免疫調節及抗腫瘤方面更屬于結構新穎的化合物，已申請相關專利。本文測定了化合物DCHDU的解離常數，是對該化合物理化常數的補充，并為化合物DCHDU進一步藥學研究的開展提供依據。

解離常數常用的測定方法有電勢法、分光光度法[5,6]、電導率法、毛細管電泳法等。本實驗采用分光光度法測定了化合物DCHDU的解離常數。

1 材料

1.1 儀器與試劑

TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，FE20pH計(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，AL204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。DCHDU(自制，純度>99%，GC測定)；其他試劑為分析純；水為雙蒸水。

1.2 緩沖液配制

稱取KH2PO42.443 8 g，KC1 27.924 6 g加入雙蒸水溶解后定容為1 L，取恒定離子濃度溶液(KH2PO4濃度為0.025 mol·L-1，μ=0.4)30 mL，滴加NaOH溶液(0.1,0.2 mol·L-1)，制得系列不同pH緩沖液。

2 方法與結果

2.1 測定方法的選擇

DCHDU在甲醇溶液中在212 nm處有最大吸收峰，其紫外吸收光譜見圖1。

圖1 DCHDU紫外吸收光譜

分別以不同pH值的緩沖液為空白參比，在200～400 nm對DCHDU的不同pH值緩沖液進行紫外掃描其紫外吸收光譜，見圖2。

圖2 不同pH緩沖液中DCHDU紫外吸收光譜

結果顯示pH 3.23～5.00 DCHDU的紫外吸收光譜行為一致，可認為pH在5.00以下DCHDU呈分子狀態；在pH 10.57～11.26，DCHDU的紫外吸收光譜行為也一致，即完全呈解離狀態；而在pH 6.46～8.15的各種緩沖液中DCHDU存在不同的分子型和離子型。由于DCHDU在不同pH的緩沖液中的紫外吸收光譜存在較大差異，因此，可以利用分光光度法測定其解離常數。

2.2 測定方法

精密稱取DCHDU 12.5 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。精密量取500 μL溶液(共14份)，分別置5 mL容量瓶中，加入不同pH緩沖液定容，制得供試品DCHDU的濃度為12.5 μg·mL-1，室溫下測定供試品pH，并以相應溶劑為參比，測定各供試品溶液的吸光度。

2.3 測定波長選擇

DCHDU的最大吸收峰位置隨pH的變化發生轉移，選擇在220，227，234，240 nm等波長下，樣品在離子狀態吸光度隨pH值的變化更為敏感，曲線變化更為明顯，故選擇這些波長對DCHDU的解離過程進行研究。

2.4 讀數時間的選擇

按照測定方法選取加入不同pH緩沖液的供試品，進行時間曲線掃描。結果見圖3。

圖3 不同pH緩沖液中DCHDU紫外吸收時間掃描圖

表明DCHDU在不同pH緩沖液下，其吸光度隨時間逐漸增大，在離子和分子結構同時存在的情況下其增大速度要快于只存在離子或分子的狀態，可能與酸堿條件下導致酰脲結構不穩定有關。因此，選擇在溶液配制后5 min內讀數。

2.5 測定結果及pKa的計算

按照上述測定方法，不同pH值供試品溶液分別在220，227，234，240 nm處測定吸光度，見表1。將表1中在同一波長的pH 6.16(AHR)、pH 10.57(AR-)及二者之間pH值(A)所測得的吸光度值代入公式pKa=lg(A-AR-)/(AHR-A)+pH，計算得pKa值，結果見表2。

表1 不同pH值DCHDU的吸光度

注：n=3

表2 DCHDU的解離常數

2.6 A-pH 曲線法作圖求pK值

根據公式pKa=lg(A-AR-)/(AHR-A)+pH，當A=(AHR+AR-)/2時，所對應的pH值即為pKa。在230 nm波長處測得DCHDU的吸光度，以A-pH作圖，得圖4所示曲線，以A=(AHR+AR-)/2點向橫坐標做垂線，求得DCHDU的解離常數pKa為6.98。

圖4 234 nm處DCHDU的A-pH曲線

3 討論

酸堿解離常數(pKa)是藥物重要的ADME(吸收，absorption；分布，distribution；代謝，metabolism；及排泄，excretion)性質之一，藥物的許多重要性質都與pKa有著密切的聯系。比如解離常數(pKa)與藥物穿過細胞膜的過程有相關性，這對藥理研究和新藥開發都具有重要意義。

用紫外分光光度法測定物質的pKa時，無需知道供試液中物質的準確濃度，只要求各供試液中物質的濃度相等，但物質的解離常數受緩沖體系、離子強度和有機溶劑的影響。本文選擇磷酸鹽緩沖體系并固定離子強度，因無水乙醇會使緩沖體系發生改變，故選用甲醇，以降低誤差。

[1] 秦箐，賀海平，Soren Brogger Christensen，等.中藥板藍根中高級不飽和脂肪酸的分離鑒定及免疫活性成分的研究[J].中國現代醫學雜志，2001，11(1)：15-16.

[2] Yongzhi Wang , Qing Qin, Jibing Chen, et al. Synergistic effects of Isatis tinctoria L. and tacrolimus in the prevention of acute heart rejection in mice[J]. Transplant Immunology, 2009, 22: 5-11.

[3] Kong X , Chen J, Qin Q, et al. Isatis tinctoria L. combined with co-stimulatory molecules blockade prolongs survival of cardiac allografts in alloantigen-primed mice [J]. Transplant Immunology, 2010, 23: 34-39

[4] 王聞楚，秦 箐，高明星，等. N,N′-二環己基-N-山崳酸酰脲的合成及其抗腫瘤活性研究[J]. 廣東化工，2010，37(2)：48-49，71.

[5] 劉西京，楊大堅，羅潔英，等.紫外分光光度法測定葛根素的解離常數[J].時珍國醫國藥，2006，17(11)：2206-2207.[6] 余 陳，何正標，王 敏，等.雙波長分光光度法測定有機弱酸弱堿的解離常數[J].分析科學學報，2007，23(4)：401-404.

DeterminationofDissociationConstantofN,N′-Dicyclohexyl-N-DocosanoylUrea

LIU Quan-jun1, Kuang Xiao-cong2, Wang Wen-chu1, Mo De-huan1,Qin Qing1

(1.Dept.ofNaturalProductsChemistry,SchoolofPharmaceuticalSciences,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China; 2.Dept.ofPathophysiology,SchoolofPreclinicalSciences,GuangxiMedicalUniversity,Nanning, 530021,China)

Objective: To determine the dissociation constant of N, N′-dicyclohexyl-N-docosanoyl urea.Methods: The dissociation constant of N, N′-dicyclohexyl-N-docosanoyl urea is detected by ultraviolet spectrophotometry(UV) and A-pH curves.Results: The dissociation constant of N, N′-dicyclohexyl-N-docosanoyl urea is 7.16±0.24 by UV and 6.98 by A-pH curves.

N, N′-dicyclohexyl-N-docosanoyl urea; Dissociation constant; Ultraviolet spectrophotry; A-pH curves

國家自然科學基金資助項目(30560186)，廣西科技廳廣西科學基金項目(桂科自0728128)，2007年廣西研究生教育創新計劃項目，廣西科技廳廣西科學基金項目(桂科自0991147)

*秦箐，E-mail：qqyx103@163.com

2010-12-01)