核盤菌和草酸誘導下的油菜幾種酶活力的變化分析

毛 瑋 ， 侯 英 敏， 劉 志 文

( 大連工業大學 生物工程學院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

油菜菌核病(Sclerotiniasclerotiorum)是由子囊菌亞門柔膜菌目核盤菌引起的一種真菌性病害，在油菜各個生育期和各部位均能為害，尤其以莖部受害最重。菌核病已成為一種世界性的病害，嚴重地影響了世界各國的油菜生產，在我國各油菜產區，特別是長江中下游產區，表現得尤為突出[1]。

關于油菜菌核病菌致病的生化機理，有研究表明核盤菌分泌的草酸毒素和纖維素酶等多種胞壁降解酶起著重要作用[2]，可以共同作用破壞植物細胞壁細胞。也有報道，草酸可誘導油菜體內PPO、POD活性的變化，這些酶活性的變化與油菜的抗病機制有密切的關系[3]。此外，幾丁質酶在植物抗性中的作用也引起了學者們的注意[4]。

本實驗采用草酸與核盤菌分別處理離體的油菜葉片，系統分析油菜葉片中PPO、POD、纖維素酶與幾丁質酶活力的變化，探討這些酶與油菜菌核病致病機理及抗病機制的關系，為進一步防治菌核病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)由華中農業大學油菜研究室提供；甘藍型油菜華協一號由甘肅省種子推廣總站提供，種植于溫室的營養缽中。

1.2 方 法

1.2.1 采樣與接種

將核盤菌菌核移入PDA平板培養基上，在26 ℃下進行活化培養，待瓊脂平板上長滿菌絲后用打孔器打成直徑為0.5 cm的菌絲瓊脂塊，供接種用。

選6葉期生長健壯的油菜葉片進行離體處理，第1組為接入菌絲瓊脂塊，將離體葉片葉柄基部浸入盛有清水的平皿中，并用保濕棉保濕，用無菌鑷子夾菌絲瓊脂塊，放在葉片中部，將有菌絲的一面緊貼葉片正面；第2組為草酸溶液浸葉，將離體葉片葉柄基部浸入3 mmol/L草酸溶液中，保濕；第3組為清水對照組，將離體葉片浸入清水并保濕；各組處理設3次重復，分別測定各次重復的酶活力。

1.2.2 酶活力的測定

1.2.2.1 POD和PPO活性的測定

稱取鮮重0.1 g的葉片，于10 mL 0.1 mol/L pH 6.5的 PBS 冰浴中研磨，8 000 r/min離心10 min，上清即為粗酶液。

POD活性測定參照張笑宇[5]的方法：分別加入1 mL 0.1 mol/L pH 6.0 的PBS、2 mL 3% H2O2、1 mL 0.2 mol/L的愈創木酚溶液、1 mL粗酶液，于室溫反應4 min后，在波長470 nm下測OD值。定義OD470每分鐘變化0.1所需的酶量為一個酶活力單位。

PPO活性測定也參照張笑宇[5]的方法：分別加入4 mL 0.2 mol/L 鄰苯二酚溶液、1 mL 粗酶液，40 ℃水浴10 min后在波長400 nm下測OD值。定義OD400每分鐘變化0.1所需的酶量為一個酶活力單位。

1.2.2.2 纖維素酶活性的測定

稱取鮮重0.2 g的葉片，用2 mL 0.1 mol/L pH 4.6 的HAc-NaAc溶解制成粗酶液。纖維素酶活性測定采用DNS法[6]。加入0.1 mL 1% CMC底物、0.4 mL PBS、1 mL粗酶液，50 ℃下水浴30 min。加入2 mL DNS，煮沸5 min。在520 nm下測OD值。定義每小時生成1 mg還原糖為一個酶活力單位。

1.2.2.3 幾丁質酶活性的測定

稱取鮮重0.2 g的葉片，用2 mL 0.1 mol/L pH 5.0 HAc-NaAc制成粗酶液。按Boller等[7]的方法測定幾丁質酶活力。加入0.1 mL幾丁質溶液、0.4 mL PBS、1 mL粗酶液，35 ℃下水浴1 h。加入2 mL DNS，煮沸5 min。在520 nm下測OD 值。定義每小時生成1 mg還原糖為一個酶活力單位。

2 結果與分析

2.1 葉片的選擇

不同生育期的油菜其酶活力差異較大，選擇生育期為6葉期與20葉期油菜進行PPO與POD活力測定。在預實驗中，將菌絲塊分別接種于生育期為6葉期與20葉期油菜的同一部位葉片，結果表明核盤菌侵染6葉期葉片的速度較快且病斑面積較大。

由表1可以看出，20葉期油菜的PPO活力較6葉期高，此外6葉期與20葉期油菜都含有大量的POD，且20葉期的POD活力明顯高于6葉期，這是因為過氧化物酶能使組織中所含的某些碳水化合物轉化成木質素，增加木質化程度[8]。因此綜合以上結果考慮選用6葉期油菜的葉片為實驗材料。

表1 不同生長期PPO、POD活力

2.2 草酸濃度的選擇

選擇同一時期播種的6 葉期油菜的葉片，將離體葉片葉柄分別浸入到盛有3、6、9 mmol/L草酸溶液的平皿中，并以清水為對照。72 h后分別測PPO與POD活力，結果如圖1所示。由圖1可以看出，PPO、POD活力隨著草酸濃度增加而增大，但在6和9 mmol/L浸葉過程中草酸對葉片的損傷很大，干枯現象嚴重，影響了酶活力的測定和分析，故選用草酸濃度為3 mmol/L。

圖1 不同草酸濃度浸染后PPO、POD的變化

Fig.1 The activity of PPO and POD induced by different oxalic concentration

2.3 PPO和POD活力的變化

如圖2、3所示，經草酸和核盤菌處理后，PPO和POD活力均有明顯變化。從圖2可以看出，在核盤菌誘導48 h內，PPO活力較對照略有升高，但效果不明顯；誘導48 h后PPO活力開始升高，且都高于對照組。PPO活力在核盤菌誘導72 h后達到峰值，為43.4 U/g，較對照提高了42.76%，72 h后逐漸開始下降；草酸誘導96 h后PPO活力最高，為36.7 U/g。從圖3可以看出，POD的活性隨誘導時間的延長呈先升高后降低的趨勢，經過核盤菌和草酸誘導12 h后達到最大，分別為37.5和35.1 U/g；在48 h后開始逐漸下降，96 h接近對照組。

圖2 草酸處理和接種核盤菌后葉片中PPO活力的變化

Fig.2 PPO activity in leaves soaked in oxalic acid solution and inoculated withS.sclerotiorum

圖3 草酸處理和接種核盤菌后葉片中POD活力的變化

Fig.3 POD activity in leaves soaked in oxalic acid solution and inoculated withS.sclerotiorum

2.4 纖維素酶活力的變化

如圖4所示，草酸和核盤菌誘導初期，纖維素酶活力變化不明顯，隨著誘導時間的延長，48 h后酶活力開始逐漸升高，且均高于對照組，可推斷核盤菌在48 h后開始分泌纖維素酶。在接種核盤菌96 h后酶活達到高峰，為3.11 U/g，草酸誘導72 h后酶活力達到最大，為1.03 U/g。

圖4 草酸處理和接種核盤菌后葉片中纖維素酶活力變化

Fig.4 Cellulase activity in leaves soaked in oxalic acid solution and inoculated withS.sclerotiorum

2.5 幾丁質酶活力的變化

如圖5所示，幾丁質酶在核盤菌和草酸誘導48 h內活力變化不明顯；在核盤菌誘導48 h后，幾丁質酶活力大幅升高，72 h左右達到最大，為1.44 U/g，隨著誘導時間的延長，活力逐漸開始下降。草酸誘導48 h后也使得幾丁質酶活力升高，但沒有核盤菌作用明顯。

圖5 草酸處理和接種核盤菌后葉片中幾丁質酶活力變化

Fig.5 The change of chitinase activity in leaves soaked in oxalic acid solution and inoculated withS.sclerotiorum

3 討 論

實驗結果表明，核盤菌和草酸都可以誘導油菜葉片中PPO和POD的活性提高，從而提高植物的抗病性。分析酶活力升高的原因，一方面是油菜發病后激活了相應的與POD和PPO有關的信號分子，使POD和PPO次生代謝增強，其含量增加[9]；另一方面PPO和POD參與酚類物質的氧化，植物受病原菌侵染時會生成大量具有抗菌素性質的酚化合物，殺死寄主本身細胞的同時也能殺死侵染的病原物，因此PPO和POD活性的增加可以大大增加酚氧化物的含量，從而增強植物抗病的能力。

纖維素酶被認為與病菌的致病力密切相關，在發病過程中可能起一種分解寄主組織細胞壁提供營養的作用[10]。實驗結果表明，在接種核盤菌96 h后纖維素酶活力達到最大，說明核盤菌入侵葉片組織時大量分泌纖維素酶，加快了核盤菌對細胞壁結構的破壞，使葉片迅速腐爛。同時核盤菌所分泌的草酸降低了組織的pH使酶活性達到高峰，充分說明了草酸和纖維素酶是油菜菌核病重要的治病因子。

有研究表明，幾丁質酶可以水解真菌細胞壁中的幾丁質。在本研究中，核盤菌和草酸侵染72 h后幾丁質酶活力大大提高，分解核盤菌細胞壁中的結構物質，將幾丁質水解成小分子的還原性寡糖，具有攻擊細胞壁的能力，推斷幾丁質酶參與植物防衛反應。

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