響應面優化產堿性蛋白酶菌株的產酶條件

顧 艷 麗， 張 慧， 劉 賽 男， 李 憲 臻

( 大連工業大學 生物工程學院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

近年來，堿性蛋白酶作為工業催化劑得到廣泛使用。與傳統的化學催化劑相比，堿性蛋白酶具有催化能力強、底物專一性高等優點，已被應用于制革、銀回收、醫藥、食品、飼料、化學工業、廢物處理等生產及行業[1]，尤其是作為無磷洗衣粉的添加劑使用，已使堿性蛋白酶商業制劑的銷售占整個蛋白酶市場的1/3以上，顯示出良好的使用性能和經濟價值。但國產堿性蛋白酶己不能滿足洗滌劑工業發展的需求，大規模工業用堿性蛋白酶主要依賴于國外進口。因此，尋找一種能分泌具有良好酶學特性并適用大規模洗滌劑工業生產的堿性蛋白酶高產菌種，具有重要的理論意義和應用價值。本研究在前期菌株篩選的基礎上對篩選出的產堿性蛋白酶菌株I13進行產酶條件的響應面[2]優化，最終確定了該菌株較佳的產酶條件。

1 材料與方法

1.1 菌 株

實驗室前期工作分離篩選獲得的保藏菌種。

1.2 培養基

種子培養基：蛋白胨0.5 g，酵母粉0.5 g，干酪素0.1 g，葡萄糖1 g，氯化鈉1 g， 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 10.5) 100 mL，滅菌后用5 mol/L氫氧化鈉調pH至10.5。

基本發酵培養基：葡萄糖1 g，酵母粉1 g，氯化錳0.05 g，干酪素0.1 g，氯化鈉1 g，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 10.5) 100 mL，滅菌后用5 mol/L氫氧化鈉調pH至10.5。

1.3 培養方法

種子培養：將實驗室的保藏菌種接一環到種子培養基中，于20 ℃、160 r/min的條件下進行振蕩培養，取OD600=0.15的發酵液作為種子液。

發酵培養：取種子培養液以5%接種量接入發酵培養基，20 ℃、160 r/min振蕩培養36 h，離心取上清液即為粗酶液。

1.4 酶活力的測定方法

采用Folin-酚法測定堿性蛋白酶活力。將150 μL粗酶液和150 μL 2%酪蛋白的磷酸緩沖溶液(pH 10.5)40 ℃預熱3 min后混合，于40 ℃反應10 min，立即加入0.4 mol/L三氯乙酸(TCA)300 μL終止反應。于9 000 r/min離心10 min后取上清液300 μL，加入Na2CO31.5 mL、福林酚試劑300 μL，40 ℃顯色20 min，于722S分光光度計測OD680。以TCA滅活后的酶液作為對照。在40 ℃、pH 10.5條件下每分鐘催化水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需要的酶量為一個酶活力單位。

1.5 Plackett-Burman設計篩選

采用Plackett-Burman設計法[2-4]和Minitab15數據處理軟件[5]創建試驗次數N=12的試驗，對葡萄糖(A)、酵母粉(B)、NaCl(C)、MnCl2(D)、溫度(F)、起始pH(G)、接種量(H)和裝液量(J)8個因素進行考察，另設2個虛擬列(E、K)，以考察試驗誤差，以酶活力為響應值考察各因素對產酶影響的顯著性。

1.6 最陡爬坡試驗

最陡爬坡法[6]以試驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值的大小確定變化步長，建立有效的響應面擬合方程。

1.7 響應面分析

響應曲面分析法(RSM)中的試驗設計(Box-Behnken)是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法。本試驗利用Minitab15 數據處理軟件設計一個三因素三水平共15個試驗點的試驗，得到最佳的產酶條件，以提高酶活力。

2 結果與討論

2.1 Plackett-Burman設計篩選結果

根據前期單因素試驗確定的最佳碳源、氮源等條件，選用試驗次數N=12的試驗設計，對10個因素(8個實際因素、2個虛擬因素)進行考察，分別對應于表1的10列，每個因素取2個水平，以堿性蛋白酶活力為響應值。選擇置信度較高的因素作為顯著因素進一步考察，試驗設計及結果如表1所示，各因素主效應分析結果如表2所示。

表1 篩選試驗設計及試驗結果

表2 Plackett-Burman設計的因素與水平

由表1、2可以看出，接種量、酵母粉和培養溫度這3個因素對酶活力影響極顯著，其他5個因素對酶活力影響顯著，所以將接種量、酵母粉和培養溫度這3個因素進一步進行優化。由表2可看出，接種量對發酵產酶有顯著正效應，酵母粉和培養溫度對發酵產酶有顯著負效應。若要提高產酶量，應該加大接種量，減少酵母粉濃度，降低培養溫度。而其他條件的取值根據各因素效應的正負和大小，正效應的因素取較高值，負效應的因素取較低值。

2.2 最陡爬坡試驗

由Plackett-Burman篩選出的3個主要因素的效應和大小比例設計其最陡爬坡路徑，其中接種量有顯著正效應，應增加；酵母粉和培養溫度有顯著負效應，應減少。設計結果如表3所示。

表3 最陡爬坡試驗設計及其結果

由表3可以看出，最優產酶條件在試驗3和試驗5之間，故以試驗4的條件為響應面試驗的中心點。

2.3 響應面分析結果

2.3.1 Plackett-Burman設計及結果

以Plackett-Burman設計篩選出的3個極顯著因素，結合最陡爬坡試驗，選取試驗4為中心點，采用Box-Behnken試驗設計對菌株I13的產酶活力進行三因素三水平的響應面分析試驗，共12個析因點和3個區域中心點(零點)。析因點是自變量取值在各因素所構成的三維頂點，區域中心點用以估計試驗。各參數所代表的因素及水平如表4所示。

表4 Box-Behnken試驗設計的因素與水平

利用Minitab15數據處理軟件對15個試驗點的響應值進行分析，以酶活力為響應值，經二次多元回歸擬合，確定酶活力的預測值對酵母粉、溫度、接種量的二元多次回歸方程。試驗結果如表5所示。

表5 Box-Behnken設計及試驗結果

回歸方程為

Y=315.7+7.02A-9.31B+19.76C-

54.71A2-28.09B2-30.89C2-

0.23AB+0.61AC-0.83BC

對回歸方程求一階偏導數等于零，可得到3個方程：

7.02-109.42A-0.23B+0.61C=0

(1)

-9.31-0.23A-56.18B-0.83C=0

(2)

19.76+0.61A-0.83B-61.78C=0

(3)

聯立方程組(1)、(2)、(3)求解，得出模型的極值點：A=0.07，B=-0.16，C=0.32。產堿性蛋白酶菌株產酶的最優理論條件為：酵母粉質量濃度為10.2 g/L，溫度為14.68 ℃，接種量為5.32%。由回歸方程可以確定最大酶活力為321.34 U/mL。

2.3.2 二次回歸擬合及方差分析

由回歸系數的顯著性分析(表6)可知該模型是顯著的，回歸方程中C、A2、B2、C2對Y值影響極顯著，B對Y值的影響顯著，其他項的系數均不顯著，說明試驗因子的線性和二次項對響應值都有很大關系，而交互項的影響相對較小。

表6 回歸系數顯著性分析

由方差分析結果(表7)可知，模型的復相關系數的平方R2=97.29%，失擬項P=0.997，沒有顯著性的影響，說明二次回歸方程的擬合程度很好，失擬較小，不需引入更高次數的項。該模型可以用于產堿性蛋白酶菌株產酶條件優化的理論預測。

表7 模型方差分析

2.3.3 響應曲面及等高線分析

將表5的試驗結果經Minitab15分析軟件處理，繪制其響應面曲線及等值線，見圖1～3。圖1～3直觀地給出了各個因子對酶活力影響的曲面圖及等高線圖，酵母粉、培養溫度和接種量都存在著相關性。圖1表明，當接種量位于中心水平時，酵母粉和培養溫度對酶活力影響的交互作用較顯著，因為等高線的形狀反應了交互作用的顯著性，等高線圖接近圓形則交互作用不顯著，等高線圖呈橢圓形則交互作用顯著。由曲面圖及等高線圖可以直觀看出酵母粉和培養溫度的交互作用較顯著。

圖1 酵母粉(A)和培養溫度(B)對酶活力影響的曲面圖及等高線圖

圖2 酵母粉(A)和接種量(C)對酶活力影響的曲面圖及等高線圖

圖3 接種量(B)和培養溫度(C)對酶活力影響的曲面圖及等高線圖

圖2是當培養溫度位于中心水平時的交互作用較顯著，酵母粉和接種量對酶活力影響的曲面圖及等高線圖。可以看出等高線圖呈橢圓形，交互作用較顯著。

圖3是當酵母粉位于中心水平時，接種量和培養溫度對酶活力影響的曲面圖及等高線圖。可以看出等高線圖呈圓形，交互作用不顯著。

2.3.4 最佳產酶條件的確定及驗證試驗

由求得的最優回歸方程得到酶活力達到最大值時，酵母粉質量濃度為10.2 g/L，溫度為14.68 ℃，接種量為5.32%，此時的最大酶活力為321.34 U/mL。為檢驗結果的可靠性，采取響應面分析法求得的最佳條件進行3次平行試驗,結果得出酶活力分別為320.56、322.17、323.05 U/mL，均值為321.93 U/mL，與理論預測值基本吻合，平均誤差為0.18%。因此，利用響應面分析法得到菌株I13最佳產酶條件真實可靠,具有實際意義。

3 結 論

堿性蛋白酶是在堿性范圍內水解蛋白質肽鍵的酶類，是應用于工業生產中最為廣泛的酶類之一。本研究是對前期篩選出的一株產堿性蛋白酶高產菌種用響應面法對其產酶條件進行優化。利用Minitab15數據處理軟件優化了產堿性蛋白酶菌株的產酶條件，確定了接種量、酵母粉和培養溫度這3個對酶活力影響極顯著因素，用響應面曲線及等值線擬合出一個二次回歸方程，找出產酶的最優組合為：酵母粉質量濃度10.2 g/L、培養溫度14.68 ℃和接種量5.32%。用此最佳產酶條件進行了3次平行試驗，其均值與理論預測值基本吻合。因此，經過響應面法的優化，堿性蛋白酶活力可達到321.34 U/mL，比優化前提高了151%。

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