磁性殼聚糖微球固定化脂肪酶的研究

常 凱， 王 紅 英， 孫 井 輝， 錢 斯 日 古 楞

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

脂肪酶是目前用途最廣泛的酶催化劑之一[1]。現(xiàn)在很多學(xué)者正在研究利用脂肪酶，把人類生活和工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的劣質(zhì)油催化生成生物柴油[2]。這種新技術(shù)為解決能源危機、環(huán)境保護等世界性難題提供了新的途徑。但由于游離的脂肪酶對溫度和酸堿強度都有著嚴格的要求，儲存困難，而且價格偏高、不易回收利用等特點，很大程度上限制了脂肪酶在人類環(huán)保產(chǎn)業(yè)等中的應(yīng)用。殼聚糖是一種生物相容性好、易生物降解、無毒無副作用的天然高分子材料，其分子表面存在著豐富的羥基和氨基等官能團。近年來磁性高分子載體固定脲酶、糖化酶等的研究已有報道[3-4]，而采用磁性殼聚糖微球固定脂肪酶，還未見報道。用具有磁性的殼聚糖微球固定化脂肪酶，不僅能保持脂肪酶催化高效性和專一性，而且能提高脂肪酶的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性[5-7]，易于分離，有利于脂肪酶的重復(fù)性使用及產(chǎn)品的純化，從而降低脂肪酶的使用成本。本文通過戊二醛與殼聚糖的氨基基團交聯(lián)，對殼聚糖進行改性以增強了脂肪酶的結(jié)合力，從而提高脂肪酶的操作穩(wěn)定性；同時對固定化條件和固定化酶性質(zhì)等進行系統(tǒng)的研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

脂肪酶，活力為6 733.58 U/g，Sigma公司；殼聚糖，分析純，上海緣聚生物科技有限公司；聚乙烯醇，分析純，天津市天河化學(xué)試劑廠；橄欖油，分析純，上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站；其他試劑均為分析純。

1.2 方 法

1.2.1 固定化脂肪酶載體的制備

1.2.1.1 改性納米級磁流體的制備

用共沉淀法[8]制備納米級磁流體。將5 g FeCl2·4H2O和3.4 g FeCl3·6H2O分別溶解于40 mL蒸餾水中，配制成Fe2+濃度為0.2 mol/L，F(xiàn)e3+濃度為0.125 mol/L的溶液。然后將Fe2+和Fe3+溶液混合置入250 mL三口燒瓶中，加入150 mL去離子水，在10 000 r/min條件下高速攪拌。同時緩慢滴加3 mol/L的NaOH，當(dāng)溶液變得黑亮?xí)r停止加入NaOH，繼續(xù)攪拌30 min。然后向三口燒瓶中加入0.5 mL油酸，攪拌1 h。用無水乙醇和去離子水反復(fù)清洗至上清液無色透明，得到改性磁流體，50 ℃下干燥，密閉常溫保存。

1.2.1.2 納米級磁性殼聚糖微球的制備

將1 g改性的磁流體和40 mL用乙酸(體積分數(shù)2%)溶解的殼聚糖溶液加入燒杯中，在功率1 000 W、間隙時間1 s、超聲時間1 s條件下，超聲波冰浴分散10 min。將分散好的溶液置入250 mL三口燒瓶內(nèi)，加入100 mL去離子水，37 ℃恒溫水浴加熱并1 000 r/min攪拌。緩慢滴加100 μL 戊二醛(體積分數(shù)為50%)，攪拌1 h，加入適量Span-80和吐溫80。繼續(xù)以1 000 r/min速度攪拌30 min，開始滴加1 mol/L的NaOH。在pH達到7之前的速度較快，每4 s一滴。然后再以每8 s一滴的速度滴加到pH 9，停止滴加。緩慢加入100 μL乙二胺，800 r/min攪拌3 h。停止攪拌，用無水乙醇和超純水反復(fù)清洗，在4 ℃的冰箱中保藏。

1.2.2 脂肪酶的磁性固定化

稱取100 mg磁性微球，用3%的戊二醛溶液活化2 h。用無水乙醇和超純水反復(fù)清洗干凈，然后加入100 mL錐形瓶中，用緩沖液充分溶脹，取出。將溶脹的磁性殼聚糖微球加入體積分數(shù)2%的脂肪酶磷酸溶液(用pH 8.0，0.2 mol/L緩沖液配制)，15 ℃恒溫搖床振蕩一定時間，用磁鐵將磁性殼聚糖微球沉淀，過濾，并用pH 8.0，0.1 mol/L緩沖液洗滌，然后用無水乙醇和超純水反復(fù)清洗多次，最后獲得固定化酶，在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 固定化脂肪酶活力的測定

固定化脂肪酶活力測定采用聚乙烯醇乳化橄欖油法[9]。脂肪酶的活力單位表述為，在pH 8、37 ℃條件下，脂肪酶水解橄欖油每分鐘生成1 μmol脂肪酸所需的酶量，即為一個酶活單位。由酸堿平衡方程可以計算得出催化生成的脂肪酸的量。首先，要取一定量的聚乙烯醇(PVA)，配制成體積分數(shù)2%的水溶液(隔夜溶脹)。量取一定量的橄欖油，與聚乙烯醇按3∶1體積比混合，立即置入冰水中。10 ℃時迅速用勻漿機高速攪拌20 min，白色的混合物即為反應(yīng)底物。然后取2.0 mL 0.1 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖溶液和2.5 mL 底物置入同一三角瓶里，用磁力攪拌器攪拌3 min，并用水浴加熱到37 ℃，在此溫度下恒定10 min，最后加入0.5 mL脂肪酶液，低速攪拌并計時，恒溫反應(yīng)30 min后，再加入5.0 mL丙酮-乙醇混合液(體積比為1∶1)終止脂肪酶的水解反應(yīng)，然后加入5.0 mL 0.05 mol/L的NaOH標準溶液和2滴1%的酚酞指示劑，最后用0.05 mol/L的鹽酸標準溶液滴定，直至溶液變成透明無色。采用聚乙烯醇乳化橄欖油法測定對照樣的酶活力，在加酶之前先加入5.0 mL丙酮-乙醇混合液(體積比為1∶1)以終止脂肪酶的水解反應(yīng)。采用聚乙烯醇乳化橄欖油法測定固定化酶的酶活力，加入固定化酶的酶量是0.1 g。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶固定化條件的研究

2.1.1 固定化最佳給酶量的確定

取6組經(jīng)活化處理的磁性殼聚糖微球，每組100 mg，分別加入酶量6、8、10、12、14、16 mg。15 ℃恒溫振蕩7 h，用磁鐵將磁性殼聚糖微球沉淀、過濾，并用pH 8.0，0.1 mol/L磷酸緩沖液洗滌，然后用無水乙醇和超純水反復(fù)清洗多次，用“1.2.3”方法測定酶活力。

由圖1可知，酶活性隨給酶量的增加先上升后下降。這是因為殼聚糖微球的表面有一定數(shù)量的活性基團，這些活性基團能夠和酶相結(jié)合。如果活性基團和酶的結(jié)合沒有飽和，固定化酶的總活力就會隨著吸附酶量的增多而增大。當(dāng)給酶量為10 mg時，微球表面活性基團已經(jīng)和酶的結(jié)合飽和。這時再增加給酶量，酶不但不和活性基團結(jié)合，反而使酶都聚集在一起，酶的活性中心相互掩映，所以酶活性下降。綜合考慮，每100 mg磁性殼聚糖微球的最佳加酶量為10 mg。

2.1.2 固定化最佳時間的確定

取6組100 mg活化后的磁性殼聚糖微球，分別在15 ℃下恒溫振蕩5、6、7、8、9、10 h。用磁鐵將磁性殼聚糖微球沉淀后過濾，并用pH 8.0，0.1 mol/L磷酸緩沖液洗滌，然后用無水乙醇和超純水反復(fù)清洗多次，用“1.2.3”方法測定酶活力。

圖1 脂肪酶加量對固定化脂肪酶活力的影響

Fig.1 Effect of lipase amount on the activity of immobilized lipase

由圖2可見，隨著固定化時間的延長，固定化脂肪酶活性呈現(xiàn)先增加后降低。固定化時間過短，有部分脂肪酶和載體沒有結(jié)合，因而固定化酶活性較低；當(dāng)固定化的時間過長，會使固定化酶活性降低，因此最佳固定化時間為7 h。

圖2 固定化時間對固定化脂肪酶活力的影響

Fig.2 Effect of immobilizing time on the activity of immobilized lipase

2.1.3 固定化最佳pH條件的確定

取100 mg磁性殼聚糖微球7份置入三角瓶中，然后各加入1 mL 配置好的脂肪酶溶液，最后依次分別加入2 mL pH分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的磷酸緩沖液，固定化后測定脂肪酶酶的活力，結(jié)果見圖3。由圖3可見，脂肪酶在pH 為8.0條件下固定化，相對酶活力最高。

2.2 固定化酶的最適反應(yīng)溫度

取兩個裝有2.5 mL底物的錐形瓶和2.0 mL 0.2 mol/L pH 8.0的磷酸緩沖液，分別加入100 mg固定化脂肪酶和0.2 mL體積分數(shù)2%的脂肪酶溶液，在35、40、45、50、55 ℃振蕩反應(yīng)5 min后，用“1.2.3” 方法測定活力，結(jié)果見圖4。圖4表明，自由酶和固定化酶的最適溫度分別為40和50 ℃，經(jīng)固定化的酶最適溫度提高了10 ℃，在30～60 ℃它仍保持較高活性。這是因為自由酶和微球表面活性基團結(jié)合后，形成一種穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能夠?qū)χ久傅幕钚灾行挠幸欢ǖ谋Ｗo，所以提高了固定化脂肪酶的臨界變性溫度。固定化脂肪酶最適反應(yīng)溫度得到了提高，使脂肪酶能夠在較高溫度下進行酶促反應(yīng)，提高了其適用范圍。

圖3 pH對固定化脂肪酶活力的影響

圖4 溫度對自由脂肪酶和固定化脂肪活力的影響

Fig.4 Effect of temperature on the activity of free lipase and immobilized lipase

2.3 固定化酶反應(yīng)的最適pH值

取兩個裝有不同pH的磷酸緩沖液和2.5 mL底物的錐形瓶，分別加入100 mg固定化脂肪酶和0.2 mL體積分數(shù)2%的脂肪酶溶液，在50 ℃水浴中振蕩反應(yīng)5 min后測其活力，結(jié)果見圖5。由圖5可見，固定化酶比自由酶最適pH提高了0.5，達到了8.0。固定化酶在pH 6.5～9.0仍然保持較高的活力，抗堿性的能力明顯增加。這可能是固定化后脂肪酶的構(gòu)象發(fā)生了改變，穩(wěn)定性得到很大提高。

2.4 固定化酶操作穩(wěn)定性

連續(xù)使用磁性固定化酶測定酶活力5次，結(jié)果如圖6所示，固定化酶的活力均有緩慢下降。這是因為一些酶與微球表面的活性基團結(jié)合的不牢固，一部分酶從微球的表面脫落下來，在回收的過程中也有酶損失。但是固定化的脂肪酶經(jīng)過重復(fù)測定酶活5次后，其相對活力仍然可以保持在82.6%，表明磁性固定化酶具有很高的操作穩(wěn)定性。

圖5 pH對自由脂肪酶和固定化脂肪酶活力的影響

圖6 固定化脂肪酶的操作穩(wěn)定性

2.5 固定化酶儲存穩(wěn)定性

固定化酶和自由酶在0.2 mol/L 磷酸緩沖液(pH 8)中于4 ℃保存6 d后，測其活力，結(jié)果見圖7。由圖7可見，脂肪酶經(jīng)過磁性殼聚糖微球固定化后，其儲存穩(wěn)定性和自由酶相比有了顯著提高，在低溫儲存6 d后仍然保持較高酶活力。這是因為脂肪酶和微球表面的活性基團結(jié)合后，形成了穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，這種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)對酶的活性中心有一定的保護作用，使其經(jīng)過長時間低溫儲存后，仍然可以保持較高酶活力。經(jīng)磁性殼聚糖微球固定化的脂肪酶，和自由酶相比，儲存穩(wěn)定性得到了提高。

圖7 脂肪酶和固定化脂肪酶的儲存穩(wěn)定性

3 結(jié) 論

實驗結(jié)果表明，脂肪酶的最佳固定化條件為：100 mg磁性殼聚糖微球加入10 mg脂肪酶，在pH 8下反應(yīng)7 h。脂肪酶經(jīng)固定化后，其酸堿穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性比其自由酶明顯提高。磁性固定化脂肪酶的反應(yīng)最適pH為8，最適溫度為50 ℃，重復(fù)使用5次，其活力仍保持82.6%,表現(xiàn)良好的操作穩(wěn)定性。固定化酶在4 ℃保存6 d后，其相對活力仍可達到82%以上。脂肪酶被磁性固定化，仍保持較高催化活力，與其自由酶表現(xiàn)相似的酶學(xué)性質(zhì)，說明脂肪酶通過此方法固定化時，載體不是完全與酶的活性中心作用。根據(jù)實驗，可以認為磁性固定化技術(shù)能夠擴大脂肪酶的應(yīng)用范圍，磁性固定化脂肪酶在工業(yè)上具有應(yīng)用潛力。

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